韓明渠，李富偉，吳培均

（北京科為博生物技術(shù)研究院，北京 100086）

抗生素作為飼料添加劑在畜禽動(dòng)物防病、抗病以及促生長(zhǎng)等方面效果顯著，為集約化畜牧業(yè)的發(fā)展做出重大貢獻(xiàn)[1]。但是，人們發(fā)現(xiàn)抗生素飼料添加劑在帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也造成了很大的危害，長(zhǎng)期濫用抗生素引起病原菌產(chǎn)生耐藥性、二重感染、破壞動(dòng)物體內(nèi)微生態(tài)平衡及降低動(dòng)物免疫功能等，這些都對(duì)養(yǎng)殖業(yè)、飼料工業(yè)和動(dòng)物帶來嚴(yán)重威脅。近年來，飼用抗生素替代品的種類較多，主要有微生態(tài)制劑、酶制劑、寡糖、植物提取物、糖萜素、酸化劑等[2]。其中，微生態(tài)制劑以其無殘留、無耐藥性、無毒副作用以及效果顯著、成本低等優(yōu)點(diǎn)而日益受到重視。微生態(tài)制劑在促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌的代謝與繁殖、維持腸道微生態(tài)平衡、提高宿主動(dòng)物免疫力、改善飼料利用率和生產(chǎn)繁殖能力以及改善環(huán)境污染等方面都有較強(qiáng)的效果[3]。

2013年我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《飼料添加劑品種目錄》中允許添加的飼用微生物有34種，其中以乳酸菌為主，包括屎腸球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌等22種乳酸菌，還有芽孢桿菌、酵母菌及真菌。乳酸菌作為最早的飼用微生物添加劑菌種，已廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖等各個(gè)領(lǐng)域。屎腸球菌具有生長(zhǎng)速度快，有較好的黏附能力，可產(chǎn)生乳酸和一些抗菌物質(zhì)[4]。1989年，美國(guó)聯(lián)邦食品和藥物管理局（FDA）和美國(guó)飼料控制官員協(xié)會(huì)（AAF?CO）就將屎腸球菌列為可直接添加于動(dòng)物飼料的菌種之一，加之其兼性厭氧的生理特性，使其與厭氧培養(yǎng)保存條件苛刻的其他乳酸菌相比，更適合于生產(chǎn)和應(yīng)用。本試驗(yàn)從健康豬腸道及其內(nèi)容物樣品中，分離獲得了一株乳酸菌CE001，采用形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)相結(jié)合的多相分類鑒定技術(shù)，將該菌株初步鑒定為屎腸球菌。

1 試驗(yàn)材料

1.1 樣品

豬腸道及內(nèi)容物樣品采自于北京資源肉制品廠屠宰流水線。

1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水1 L（pH 6.8，121℃滅菌20 min）。

固體篩選培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基+1.5%（w/v）瓊脂+1%輕質(zhì)碳酸鈣。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌種分離與純化

2.1.1 菌種分離

采用10倍梯度稀釋法對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，用無菌移液管準(zhǔn)確吸取1 mL不同稀釋度的菌液，分別放入3組平行的培養(yǎng)皿中，然后在培養(yǎng)皿中倒入已融化并冷卻至約50℃的固體篩選培養(yǎng)基，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，37℃倒置培養(yǎng)48 h。

2.1.2 菌種純化

待菌落長(zhǎng)出后，挑取鈣溶圈明顯的菌落，采用三線法接種于固體篩選培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)48 h，獲得單菌落，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)劃線純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，篩選革蘭氏陽性球菌。

2.2.2 生理生化鑒定

接觸酶、氧化酶測(cè)定及碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)方法，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序。按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取CE001菌株的基因組DNA。以基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增16S rRNA基因，擴(kuò)增引物采用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAG TTT?GATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTACC TT?GTTACGACTT-3'）（北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成）。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：10×Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，10 mol·L-1引物 1 μL，TaqDNA 聚合酶 0.1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，55℃1 min，72℃90 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃10 min延伸，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

pheS基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序。以基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增pheS基因，擴(kuò)增引物采用pheS-21F（5'-CAYCCNGCHCGYGAYA TGC-3'）和 pheS-22R（5'-CCWARVCCRAARGCAA ARCC-3'）（北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成）[6]。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：10×Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，10 mol·L-1引物1 μL，TaqDNA聚合酶0.1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃ 1 min，46℃ 135 s，72℃ 75 s，3個(gè)循環(huán)后，95℃變性35 s，46℃75 s，72℃75 s，30個(gè)循環(huán)后72℃ 7 min，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析。將所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST，然后選擇相似性較高的模式菌株序列，利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多序列同源性比對(duì)，由于序列測(cè)序結(jié)果中前后的數(shù)十個(gè)堿基的錯(cuò)誤率較高等原因，可將同源性比對(duì)結(jié)果中前后差異較大的部分去除，用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1 000次重復(fù)的Bootstraps統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 形態(tài)特征

在固體篩選平板上，菌落呈灰白色，圓形、完整、不透明；革蘭氏染色呈陽性，細(xì)胞為球形，如圖1所示。

3.2 生理生化特征

接觸酶和氧化酶反應(yīng)均呈陰性，碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)結(jié)果見附表。

圖1 菌株CE001菌落形態(tài)及顯微形態(tài)

附表 生理生化特征

3.3 16S rRNA基因和pheS基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

菌株CE001的16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果在Gen?Bank中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，其序列全長(zhǎng)為1 393 bp，與腸球菌屬的16S rRNA基因序列相似性最高。選取Lactobacillus plantarum subsp.argentoratensisDKO 22T（AJ640078）作為外類群，利用Mega 6.0軟件構(gòu)建菌株CE001與腸球菌屬部分模式種16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。如圖2所示，菌株CE001與Enterococcus faeciumATCC 19434T（DQ411813）同 處一個(gè)進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近。

3.4 pheS基因序列分析

菌株CE001的pheS基因測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，其序列全長(zhǎng)為472 bp，與腸球菌屬的pheS基因序列相似性最高。選取Lactobacillus plantarumLMG 6907T（AM087714）作為外類群，利用Mega 6.0軟件構(gòu)建菌株CE001與腸球菌屬部分模式種pheS基因系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

如圖3所示，菌株CE001與Enterococcus faeciumLMG 13590T（AJ843388）同處一個(gè)進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近。

綜合菌落形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rRNA基因和pheS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株CE001初步鑒定為屎腸球菌，在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心的保藏號(hào)為CGMCC9666。

圖2 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 pheS基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

4 小結(jié)

細(xì)菌的鑒定方法包括以形態(tài)特征、生理生化特征為參照的經(jīng)典分類法，脂肪酸指紋分析和Bio?log碳源分析等化學(xué)分類法，以及基于16SrRNA基因和持家基因的序列分析的分子生物學(xué)分類法[7-8]。其中，利用分子生物學(xué)技術(shù)根據(jù)菌株的基因進(jìn)行鑒定，可以將菌株的分類地位劃分的更確切。16S rRNA基因在原核生物中高度保守性，逐漸成為細(xì)菌檢測(cè)和鑒定的一種強(qiáng)有力工具[9]。但是，人們發(fā)現(xiàn)16S rRNA基因?qū)τ谙嘟N或同一種內(nèi)的不同菌株之間的分辨率較低。研究發(fā)現(xiàn)編碼苯丙氨酰-tRNA合成酶α亞基的pheS基因，具有高保守性和差異性且分辨率高于16S rRNA，因而被應(yīng)用于乳酸菌分子分類鑒定的研究[10]。綜合應(yīng)用表型分類、化學(xué)分類和分子分類等方法，即采用多相分類鑒定技術(shù)可得出準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

本研究中分離獲得的菌株CE001，綜合菌落形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rRNA基因和pheS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，初步鑒定為屎腸球菌，在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心的保藏號(hào)為CGMCC9666。目前，屎腸球菌在畜牧生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛，在提高生產(chǎn)性能、降低飼料利用率、維持腸道微生物菌群平衡、提高免疫力、提高肉質(zhì)品質(zhì)等方面效果顯著[11-13]。本研究在建立動(dòng)物源乳酸菌優(yōu)良菌種高效篩選及鑒定的基礎(chǔ)上，下一步將對(duì)菌株的抗逆性能、產(chǎn)酸性能和抗菌性能等生物功能進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，從而為微生態(tài)制劑的開發(fā)利用提供優(yōu)良菌種資源。

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