馬惠文

（煙臺(tái)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東 煙臺(tái) 264003）

獸藥殘留是指在畜禽等食用動(dòng)物使用藥物后，藥物發(fā)生蓄積，以藥物化學(xué)原型成分、分解中間體或雜質(zhì)等形式，存在于動(dòng)物的細(xì)胞、器官或者組織內(nèi)部。這些物質(zhì)對(duì)人的身體健康會(huì)產(chǎn)生非常嚴(yán)重的傷害或者引起病菌的耐藥性。因此，目前世界上許多國(guó)家對(duì)于動(dòng)物性食品安全的主要評(píng)價(jià)手段就是通過獸藥殘留的檢測(cè)。但是，在應(yīng)用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)過程中，發(fā)現(xiàn)有的檢測(cè)結(jié)果和試劑盒標(biāo)注的各種技術(shù)指標(biāo)存在較大差異，嚴(yán)重影響檢測(cè)人員對(duì)檢測(cè)結(jié)果的判定。因此，在采用試劑盒進(jìn)行藥物殘留檢測(cè)之前對(duì)試劑盒各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證，會(huì)大幅增加檢測(cè)人員對(duì)檢測(cè)結(jié)果判定的可信度。試劑盒的重要技術(shù)指標(biāo)主要有試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限、臨界值、定量限、精密度以及準(zhǔn)確度等。

1 酶聯(lián)免疫的基本原理及特點(diǎn)

酶聯(lián)免疫吸附方法主要是將酶的高效催化作用和抗原-抗體免疫反應(yīng)的特異性進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，因?yàn)槊傅淖饔贸霈F(xiàn)顏色反應(yīng)，然后通過現(xiàn)代光學(xué)分析儀器對(duì)光度進(jìn)行測(cè)定[1]。因此酶聯(lián)免疫吸附方法是一種非常靈敏和專屬的測(cè)試手段。

酶聯(lián)免疫吸附法的分類很多，按照其基本的反應(yīng)原理主要可以分為間接法、抗體夾心法、捕獲法以及競(jìng)爭(zhēng)法。在獸藥殘留檢測(cè)過程中經(jīng)常用的測(cè)定方法是競(jìng)爭(zhēng)法，這種方法主要針對(duì)測(cè)定小分子化合物[2]。根據(jù)試驗(yàn)的步驟不同可以分為間接法和直接競(jìng)爭(zhēng)法兩種。該方法可以用來測(cè)定抗體也可以用來定量的測(cè)定抗原和半抗原[3]。比如以抗原為例，其主要過程就是將異性的抗體吸附在固相載體上，然后加入一定量酶標(biāo)和待測(cè)抗原，二者相互之間競(jìng)爭(zhēng)和固相抗體進(jìn)行結(jié)合；然后經(jīng)過洗滌，加入底物溶液就可以產(chǎn)生顯色反應(yīng)。酶標(biāo)抗原和固相抗體發(fā)生充分結(jié)合，其分解的底物顏色很深。待測(cè)抗原量變多的時(shí)候，競(jìng)爭(zhēng)性的產(chǎn)生抑制，阻礙了酶標(biāo)抗原和固相抗體產(chǎn)生結(jié)合，因此固相抗體上的酶標(biāo)抗原量就變少，顏色就變淺[4]。

酶聯(lián)免疫吸附法其特點(diǎn)也非常顯著，主要有以下幾個(gè)方面：反應(yīng)的靈敏度非常高，因?yàn)槊傅拇呋史浅８?，這就對(duì)于反應(yīng)的效果起到了極大的推動(dòng)作用，直接使得測(cè)定方法達(dá)到了非常高的敏感度；在檢測(cè)樣品的時(shí)數(shù)量非常大，因?yàn)槠涿總€(gè)試劑盒都有96個(gè)孔，如果按照樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都做平行計(jì)算的話，那么每個(gè)試劑盒一次性可以檢測(cè)42個(gè)樣品，這數(shù)量非?？捎^，有利于直接提高檢測(cè)的效率；檢測(cè)的流程變得比較簡(jiǎn)單，一般情況下組織樣品前需要處理時(shí)間為2～3 h，利于試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)間約為1.5 h，比如對(duì)于尿液樣品來說一般都是直接去清澈樣本直接進(jìn)行試劑盒檢測(cè)需時(shí)約為1.5 h，這就直接使檢測(cè)流程變得簡(jiǎn)單易操作，復(fù)雜性大幅降低；檢測(cè)限值比較低，比如沙丁胺醇和鹽酸克倫特羅的檢測(cè)限值都在0.3～0.5 μg·kg-1，這對(duì)于防止出現(xiàn)假陰性樣品或者假陽性樣品起到了非常有效的積極作用，能夠很大程度上保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率[5]。

2 獸藥殘留檢測(cè)中ELISA的操作要點(diǎn)分析

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)結(jié)果是否可靠準(zhǔn)確的前提保障就是穩(wěn)定的試劑盒、適宜的環(huán)境、成熟的方法。

2.1 試劑盒選擇及操作環(huán)境要求

試劑盒選擇必須選用經(jīng)過我國(guó)農(nóng)業(yè)部備案的產(chǎn)品，對(duì)其質(zhì)量要做好驗(yàn)證工作，對(duì)同一種的檢測(cè)參數(shù)因?yàn)閲?guó)內(nèi)外出現(xiàn)的多種試劑盒也應(yīng)通過檢測(cè)回收率進(jìn)行多方面的驗(yàn)證工作，這有利于保障試劑盒的效果和質(zhì)量[6]。對(duì)于ELISA的操作環(huán)境也需要給予充分的關(guān)注，因?yàn)槲舛戎凳艿綔囟鹊挠绊懞艽?，隨著溫度的升高，吸光度值也會(huì)隨著變大，這就可能出現(xiàn)假陽性。在檢測(cè)的時(shí)候應(yīng)該注意對(duì)于操作環(huán)境的要求標(biāo)準(zhǔn)，由于很多試劑盒都是在2～8℃的環(huán)境中保存，因此在使用之前一定要讓試劑盒回溫到20～25℃[7]。另外在檢測(cè)前應(yīng)該保證樣品溶液的溫度和標(biāo)準(zhǔn)溶液的溫度，一般情況下都是將樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液放在同種溫度下大約30 min。有的時(shí)候需要在特定的環(huán)境下進(jìn)行檢測(cè)，次數(shù)應(yīng)該注意對(duì)于特定的溫度和時(shí)間在試驗(yàn)的過程中不能隨便的改動(dòng)，因?yàn)檫@都是試劑盒在研制過程中經(jīng)過很多次的試驗(yàn)最后得到的優(yōu)化條件。

2.2 樣品前期處理

一般情況下，樣品在進(jìn)行檢測(cè)之前都應(yīng)該進(jìn)行前期的處理，主要包括均質(zhì)、提取、離心和濃縮以及溶解等操作步驟[8]。在均質(zhì)的操作中一般都是要去除和檢測(cè)沒有關(guān)系的一些組成部分，比如在檢測(cè)“瘦肉精”的過程中，要除去脂肪的部分，只需提取肌肉部分。在進(jìn)行組分提取的時(shí)候應(yīng)該加入提取液，然后通過振蕩以及渦旋等方法，讓樣品和提取液進(jìn)行充分的混合，這能夠有利于保障被測(cè)組分充分提??；在離心分離的時(shí)候也應(yīng)該注意操作的時(shí)間和轉(zhuǎn)速要達(dá)到規(guī)定的要求標(biāo)準(zhǔn)，如果沒有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)速和合適的離心時(shí)間就可能導(dǎo)致提取失敗。在離心和濃縮工作完成后，在有兩相以上的分離時(shí)應(yīng)該保證目的相不能帶有其他的相，因?yàn)閹肫渌嘣蕉嗑蜁?huì)導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性率和假陽性率更高[9]。

2.3 試劑盒檢測(cè)問題

對(duì)于要進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒應(yīng)該保障其在使用的有效期范圍內(nèi)，因不同的試劑盒反應(yīng)的類型不同，而每個(gè)試劑盒都有不同的前期處理程序和操作程序，因此在檢測(cè)前期應(yīng)該詳細(xì)閱讀其自帶的使用說明書，對(duì)于一些特別注意事項(xiàng)一定要給予更多的關(guān)注，比如試劑盒的保存條件，不同的試劑盒不可用混合使用等，保障檢測(cè)的操作程序符合要求的標(biāo)準(zhǔn)[10]。然后在加樣品的時(shí)候應(yīng)該按照一定的順序進(jìn)行，不能隨意顛倒順序，要保證加入的樣品時(shí)間是一致的，樣品的量也要準(zhǔn)確，加入的時(shí)候應(yīng)該注意不能加到孔壁的上部，應(yīng)該加在孔底，不能濺出也不能產(chǎn)生氣泡。在加入樣品以后應(yīng)該進(jìn)行輕敲酶標(biāo)板的四周，然后在桌面上進(jìn)行圓周運(yùn)動(dòng)，這有利于保證進(jìn)行充分的混勻。洗板也是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，雖然這不是反應(yīng)試驗(yàn)步驟，但也可以決定整個(gè)試驗(yàn)的成敗，其目的主要就是洗去反應(yīng)液中沒有和抗體或者固相抗原結(jié)合的物質(zhì)，并在反應(yīng)過程中吸附在固相載體上的一些干擾的物質(zhì)，如果洗滌不夠徹底的時(shí)候，就可能導(dǎo)致有酶結(jié)合物的非特異性吸附，使得空白值增大很多。比如在進(jìn)行孵育的時(shí)候一般都是要求在一定的溫度下進(jìn)行，為了防止溶劑的蒸發(fā)，就需要搞清楚試驗(yàn)示范需要避光孵育。而且在加入終止液以后隨著時(shí)間的推移可能使得OD值變低，因此很多試劑盒都規(guī)定了在加入終止液后的讀數(shù)有效時(shí)間范圍[11]。

2.4 結(jié)果判斷

因?yàn)槊嘎?lián)免疫吸附法在獸藥殘留檢測(cè)過程中主要是用來進(jìn)行篩選，其判定的標(biāo)準(zhǔn)有以下幾個(gè)方面：現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)，采用方法的檢測(cè)限作為判定的依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)于沒有標(biāo)準(zhǔn)的，應(yīng)該采用其他檢測(cè)方法的檢測(cè)限作為判定的標(biāo)準(zhǔn)，比如采用這種方法篩選出陽性樣品通過確認(rèn)的方法進(jìn)行驗(yàn)證；應(yīng)該添加陽性的質(zhì)控樣作為對(duì)比，這有利于排除基質(zhì)效應(yīng)的干擾[12]。

3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1 定量的驗(yàn)證方法

試劑盒中應(yīng)含有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使標(biāo)準(zhǔn)曲線至少有5個(gè)不同的濃度點(diǎn)，每個(gè)濃度測(cè)定次數(shù)不應(yīng)低于5次；確定工作濃度范圍和最大殘留限量都在允許的范圍內(nèi)。IC50就是指抑制濃度為50%，也就是0濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值在50%的時(shí)候?qū)?yīng)的藥物濃度，這主要是反映了試劑盒的靈敏度。工作濃度范圍主要是指樣品中的藥物濃度范圍。

3.2 定性的驗(yàn)證方法

工作濃度范圍主要是由陽性樣品、臨界值濃度樣品以及陰性樣品進(jìn)行測(cè)定最終得到的，對(duì)于每個(gè)濃度都應(yīng)重復(fù)進(jìn)行測(cè)定，次數(shù)應(yīng)≥5次。濃度和響應(yīng)值之間存在著正比例或者反比例的關(guān)系[13]。

4 定量限和檢測(cè)限

定量限應(yīng)大于圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線中的最低濃度點(diǎn)，根據(jù)試劑盒標(biāo)注的檢測(cè)方法進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。測(cè)定次數(shù)≥6次，最終的檢測(cè)值應(yīng)和試劑盒上的定量限制進(jìn)行比較，而且還應(yīng)注意不能通過外延的方法進(jìn)行推理判斷。首先稱取20份空白樣品，然后將空白樣品根據(jù)試劑盒提供的檢測(cè)方法來進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算得到平均值，加3倍的標(biāo)準(zhǔn)差，就得到該試劑盒的檢測(cè)限。應(yīng)注意該試劑盒提供的檢測(cè)限是否和得到的檢測(cè)限相符[14]。

5 臨界值

對(duì)于一些殘留限量非常高的藥物，常用的檢測(cè)方法就是其臨界值一般為20份樣品添加MRL濃度，重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算平均值，然后減去1.64的標(biāo)準(zhǔn)差得到，也就是95%置信限出值。對(duì)于公認(rèn)的一些禁用藥物進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用臨界值作為定量限，得到的值應(yīng)達(dá)到本實(shí)驗(yàn)室操作的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，否則認(rèn)為不合格[15]。

6 交叉反應(yīng)

交叉反應(yīng)主要是指兩種不同的抗原分子但相互之間具有相同的部分或者類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，彼此發(fā)生的反應(yīng)。比如，一種藥物B的反應(yīng)率為100%，分別測(cè)定了其他各種藥物的50%抑制濃度，那么就可以得到其公式為：

7 準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確度主要用回收率來表示，回收率一般要＞40%或者試劑盒上標(biāo)注的回收率數(shù)值。而精密度主要是通過變異系數(shù)來表示，按照前期預(yù)定數(shù)量的要求進(jìn)行檢測(cè)，然后計(jì)算出結(jié)果。對(duì)于禁用的藥物其變異系數(shù)應(yīng)該滿足≤30%。對(duì)于每個(gè)平行樣之間的變異系數(shù)應(yīng)該滿足≤25%。

8 保存期

保存期是依據(jù)保存條件通過穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果最終確定的。一般情況下正常條件的保存都應(yīng)該在0、1、2、3個(gè)月進(jìn)行測(cè)定。然后可以依據(jù)保存期，在后期每間隔3個(gè)月進(jìn)行1次測(cè)定。在此推薦考慮進(jìn)行37℃的凍融和加速穩(wěn)定性方面的試驗(yàn)。

9 小 結(jié)

總之，通過試驗(yàn)進(jìn)行方法學(xué)檢驗(yàn)后，對(duì)于試劑盒所標(biāo)注的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)有了明確的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，能夠評(píng)判試劑盒是否真的能夠滿足國(guó)家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求。如果實(shí)際檢測(cè)結(jié)果和試劑盒標(biāo)示的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)都是在允許的差值范圍內(nèi)，并能夠達(dá)到國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，該試劑盒是合格產(chǎn)品，可以用來進(jìn)行藥物殘留的檢測(cè)驗(yàn)證。反之，如果檢測(cè)的結(jié)果和試劑盒標(biāo)示的各項(xiàng)指標(biāo)超過了允許的差值范圍，則可以評(píng)判該試劑盒不合格，不能用來進(jìn)行藥物的殘留檢測(cè)[16-19]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 何丹.氨芐青霉素殘留ELISA檢測(cè)方法的建立及檢測(cè)條件優(yōu)化[D].杭州:浙江大學(xué),2004.

[2] 楊揚(yáng).青霉素類藥物殘留ELISA檢測(cè)方法研究[D].杭州:浙江大學(xué),2006.

[3] 王麗娜,郝利忠,韓春曉,等.獸藥殘留檢測(cè)中酶聯(lián)免疫試劑盒的選擇原則與使用注意事項(xiàng)[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2013（7）:41-44.

[4] 沈亞安.多西環(huán)素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[5] 劉智宏,葉妮,郭文林,等.四環(huán)素類藥物多殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42（1）:318-323.

[6] 劉百紅.磺胺類藥物殘留ELISA快速檢測(cè)試劑盒的研制[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[7] 王麗英.己烷雌酚抗體的制備與ELISA方法的建立[D].無錫:江南大學(xué),2007.

[8] 田博,金堅(jiān),惠人杰,等.獸藥殘留檢測(cè)中磺胺嘧啶ELISA試劑盒的研制[J].生物加工過程,2017,15（1）:69-72.

[9] 呂珍珍,蔣小玲,劉金釧,等.免疫分析技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用[J].農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全,2012（9）:76-79.

[10] 徐偉,程鳳科,孟銀,等.酶聯(lián)免疫吸附法在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)家禽,2013,35（12）:49-50,52.

[11] 郭明星,羅志萍,余純.獸藥殘留免疫檢測(cè)質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2004（10）:14-16.

[12] 馮才偉,朱君紅,王會(huì)玲,等.酶聯(lián)免疫法測(cè)定豬肉中磺胺類藥物的殘留[J].四川畜牧獸醫(yī),2012,39（2）:27-29.

[13] 伏慧明,郭展旗,王翠英,等.獸藥殘留檢測(cè)中試劑盒的驗(yàn)證評(píng)判方法研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2008,10（2）:109-111.

[14] 蔣建云,楊學(xué)文.酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素B1[J].江西飼料,2006（6）:18-19.

[15] 陳志瑩,張新濱,趙藝,等.試劑盒法檢測(cè)獸藥殘留應(yīng)注意的問題[J].中國(guó)禽業(yè)導(dǎo)刊,2008,25（11）:41.

[16] 孫志文,羅曉琴,張德紅,等.我國(guó)獸藥殘留檢測(cè)試劑盒市場(chǎng)的規(guī)范化管理[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊,2005（11）:40-41.

[17] 劉維紅.酶聯(lián)免疫吸附法在畜產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用[J].山東畜牧獸醫(yī),2017,38（4）:61-62.

[18] 丁雪嬌,楊瑩,楊成竹,等.淺析選擇獸藥殘留ELISA試劑盒的幾個(gè)注意事項(xiàng)[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2016（2）:76-77.

[19] 張新濱,陳志瑩,朱增娟,等.運(yùn)用試劑盒法檢測(cè)獸藥殘留[J].新農(nóng)業(yè),2009（12）:42-43.