邢 進(jìn)，馮育芳，王 洪，張雪清，付 瑞，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，實驗動物資源研究所，北京 100050)

能力驗證(proficiency testing, PT)是利用實驗室間比對來判定實驗室和檢測機(jī)構(gòu)能力的活動。作為一項重要的外部質(zhì)量評價活動，利用實驗室間的比對，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評價參加者的能力。參加能力驗證活動，是實驗室證明其技術(shù)能力的一種重要方式，也是認(rèn)可機(jī)構(gòu)加入和維持國際相互承認(rèn)協(xié)議(MRA)的必要條件之一。尋求中國合格評定國家認(rèn)可委員會(CNAS)認(rèn)可和已獲準(zhǔn)認(rèn)可的機(jī)構(gòu)必須滿足CNAS的能力驗證相關(guān)政策，并按照CNAS能力驗證領(lǐng)域、頻次要求參加CNAS組織或承認(rèn)的能力驗證活動，包括能力驗證計劃、實驗室間比對和測量審核活動。[1-2]。

近年來，我國實驗動物領(lǐng)域不斷發(fā)展，許多相關(guān)研究已達(dá)到國際領(lǐng)先水平。實驗動物質(zhì)量檢測作為保障實驗動物和動物實驗質(zhì)量的根本手段，開展能力驗證活動勢在必行。通過能力驗證活動，可以增進(jìn)實驗動物檢測實驗室間的交流，發(fā)現(xiàn)自身不足，補(bǔ)充、完善內(nèi)部質(zhì)量控制技術(shù)，提高質(zhì)量檢測能力和水平。本院從2011年開始采用與CNAS聯(lián)合舉辦能力驗證活動，在病毒[3-5]、病原菌[6-8]和遺傳[9-10]檢測項目上積累了豐富的經(jīng)驗。2015年本院順利通過了CNAS能力驗證提供者(Proficiency Testing Provider，PTP)的現(xiàn)場評審，成為合格的能力驗證提供者。

實驗動物細(xì)菌檢測是實驗動物質(zhì)量檢測的重要內(nèi)容，依據(jù)《實驗動物微生物學(xué)檢測方法(2)》[11]，對常用實驗動物的檢測方法主要包含分離培養(yǎng)法和血清學(xué)方法。目標(biāo)菌主要包括感染呼吸道和腸道的病原菌。本院作為能力驗證活動的提供者，依據(jù)CNAS-RL02《能力驗證規(guī)則》[1]和CNAS-RL03《能力驗證提供者認(rèn)可準(zhǔn)則》[12]在2011、2013～2017年共開展了六次能力驗證活動，包括對7種病原菌的檢測?，F(xiàn)將其匯總?cè)缦隆?/p>

1 材料和方法

1.1 樣品制備

1.1.1 血清樣品

用標(biāo)準(zhǔn)菌株超聲波破碎制備免疫抗原，免疫小鼠和大鼠，獲得免疫血清。用ELISA和IFA方法分別測定支原體和泰澤病原體的抗體效價，制成強(qiáng)陽性、弱陽性的工作濃度和陰性樣本后分裝于螺口凍存管，至-20℃保存。

1.1.2 帶菌樣品

將目標(biāo)菌株和干擾菌株復(fù)蘇后分別采用生化鑒定和16SrDNA測序的方式進(jìn)行鑒定，確認(rèn)無誤后開展下一步制備。用滅菌生理鹽水制成菌懸液，然后按比例加入細(xì)菌保護(hù)液。與滅菌的或帶菌清楚的動物樣品均勻混合，制成帶菌勻漿。樣品分裝于螺口1.5 mL無菌凍存管中。2014年開始，樣品均采用冷凍干燥處理。見表1。

六次能力驗證中設(shè)置了免疫血清和帶菌樣品。所用菌株和樣品形式如表1。

1.2 樣品檢驗

編號前，依據(jù)CNAS-GL03[13]文件要求，采用國家標(biāo)準(zhǔn)中的方法對制備好的樣品進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性評價，確保樣品符合要求。分別隨機(jī)抽取已制備樣品總數(shù)量的10%用于均勻性和穩(wěn)定性檢驗。進(jìn)行均勻性評價時，對血清樣品采用OD值S≤0.3σ方法，對帶菌樣品定性觀察培養(yǎng)出的目標(biāo)菌落數(shù)。穩(wěn)定性評價至少進(jìn)行4℃、室溫(23℃～25℃)和36℃溫度下的存放穩(wěn)定性檢驗，血清樣品時間至少為2周，帶菌樣品時間至少為1個月。

1.3 樣品編號

除2011年采用相同編號外，其他年份的比對樣品均采用順序編號，各樣品隨機(jī)組合，由軟件自動分配，確保每個參與實驗室隨機(jī)得到3份或5份樣品，見表1。2016年樣品分組采用三種不同樣品全部隨機(jī)的方式編排，因此有可能出現(xiàn)各種組合，即可能存在3份陰性或3份陽性的極端情況。實驗室無法通過樣品編號判斷組別，防止了實驗室間對結(jié)果的相互溝通。

1.4 樣品發(fā)放

2015年之前的樣品通過EMS形式運輸，外包裝為泡沫塑料，內(nèi)至冰袋和樣品。2016年后除個別地區(qū)的限制，仍采用冰袋冷藏外，其他地區(qū)均采用干冰冷鏈運輸。

1.5 評價方法

各實驗室收到的所有樣品的測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果完全一致時，被判定為滿意結(jié)果；任何1份樣品的測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致時，即判定為不滿意結(jié)果；實驗室如果未按時限反饋結(jié)果，也將判定為不滿意結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 參與單位統(tǒng)計

從2011年、2013～2017年，共有45家單位參與了能力驗證活動，參與次數(shù)4次以上的有18家，見圖1。參與單位類型主要分為實驗動物檢測機(jī)構(gòu)、疾病預(yù)防控制中心、藥監(jiān)系統(tǒng)、科研院校和企業(yè)實驗室，見圖2。2011年只有實驗動物檢測機(jī)構(gòu)參與。其中藥檢系統(tǒng)和科研院校的數(shù)量變化相對較大。

表1 實驗動物病原菌檢測能力驗證所用菌株和樣品形式Tab.1 Strains and sample forms of PT for detection of laboratory animal pathogenic bacteria

圖2 參與單位類型Fig.2 Types of laboratories participating in PT

圖1 單位參與次數(shù)Fig.1 Laboratory participation statistics

2.2 結(jié)果匯總

2011年開展了2項比對項目，檢測血清中的抗體。2012年未開展。2013～2017年為檢測動物樣品中的病原菌。幾項能力驗證的滿意率在75%～96.2%之間。見表2。其中獲得不滿意結(jié)果的實驗室后續(xù)均通過了測量審核。

能力驗證活動沒有規(guī)定檢測方法，參與單位可根據(jù)自身情況自行選擇。參與單位多數(shù)按照國家標(biāo)準(zhǔn)中的方法進(jìn)行檢測，少數(shù)實驗室采用PCR方法直接擴(kuò)增樣品中的特異片段，也可取得滿意結(jié)果。

表2 2011年、2013～2017年實驗動物細(xì)菌能力驗證項目和結(jié)果Tab.2 Projects and results of PT for detection of laboratory animal pathogenic bacteria from 2011 and 2013-2017

3 討論

3.1 項目的選擇

2011年本院首次嘗試性開展國內(nèi)實驗室比對工作。充分考慮樣品制備和實驗室比對的可操作性，在項目選擇上遵循由易到難的原則，首先進(jìn)行的是血清學(xué)檢測項目。支原體和泰澤病原體是清潔級大、小鼠的必檢項目，在國家標(biāo)準(zhǔn)中可采用血清學(xué)方法檢測，對檢測實驗室軟硬件要求不高，可以比較方便的購買到兩種病原菌的檢測試劑盒。通過對這兩個項目的檢測，能夠直接考察參與實驗室在實驗動物病原菌血清學(xué)檢測方面的基本能力。經(jīng)過一年的準(zhǔn)備，2013年開始連續(xù)開展了四年腸道細(xì)菌檢測項目帶菌樣品的能力驗證工作。分別是對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和肺炎克雷伯桿菌的檢測。選擇這四種細(xì)菌主要有三方面原因：①易培養(yǎng)、保存和鑒定。這四種細(xì)菌對培養(yǎng)條件的要求相對較低，而且具有特征性的鑒別要點，樣品制備時容易獲得穩(wěn)定的樣品，便于后續(xù)比對實驗的開展。②陽性率高。特別是綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌，是實驗動物中腸道細(xì)菌陽性率最高的兩種病原菌，沙門氏菌和肺炎克雷伯桿菌次之，均嚴(yán)重影響動物實驗和人員健康。③等級檢測需要。沙門氏菌是國家標(biāo)準(zhǔn)中各級別動物首先要排除的病原菌，另外三種細(xì)菌均為SPF級嚙齒類和兔中必須要排除的病原菌，通過對這幾種常見的腸道病原菌的能力驗證，能夠比較全面的考察參加實驗室在腸道病原菌檢測方面的能力。經(jīng)過連續(xù)幾年的能力驗證活動，反饋結(jié)果的滿意率逐漸提高。2017年首次開展了呼吸道細(xì)菌的帶菌樣品的驗證活動，在樣品制備方面也提出了更高的要求。先期開展的項目是支氣管鮑特桿菌，作為SPF級動物必檢項目，該菌比其他呼吸道病原菌更易培養(yǎng)和保存，通過制備工藝的調(diào)整，樣品均穩(wěn)實驗獲得理想結(jié)果，為下一步呼吸道病原菌檢測項目的擴(kuò)展奠定了基礎(chǔ)。

3.2 樣品制備

目前實驗動物病原菌能力驗證的帶菌樣品中的基質(zhì)，如糞便或回盲內(nèi)容物等均經(jīng)過嚴(yán)格的檢測或滅菌處理，確保無待檢目標(biāo)菌的存在。同時，通過添加保護(hù)劑和冷凍干燥的方法，最大程度的保持樣品中受試菌的穩(wěn)定性，不受外界環(huán)境干擾。并且不斷完善準(zhǔn)確性、均勻性和穩(wěn)定性的實驗方法，建立實驗動物細(xì)菌PT樣品的質(zhì)量控制程序，確保制備出合格的PT樣品。

3.3 檢測方法

2011年開展的支原體和泰澤病原體項目檢測方法主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和間接免疫熒光試驗(IFA)方法，使用設(shè)備和試劑相對單一，操作程序成熟。使用新鮮配制的試劑，按照常規(guī)檢測方法操作均可檢測準(zhǔn)確。針對帶菌樣品的檢測方法一方面可選擇傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，對可疑菌進(jìn)行生化鑒定；另一方面也可以采用快速的PCR方法，對樣品直接提取DNA，采用特異性引物擴(kuò)增其中的目的基因。根據(jù)5項帶菌項目的檢測結(jié)果，PCR方法均獲得滿意結(jié)果。對于非常規(guī)性的實驗動物檢測實驗室而言，PCR是非常理想的方法。

3.4 不滿意結(jié)果分析

通過對反饋結(jié)果和報告的分析，將不滿意結(jié)果的原因總結(jié)為以下幾個方面：(1)培養(yǎng)時間不足。比如綠膿桿菌在初代分離培養(yǎng)時應(yīng)在NAC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至72 h；金黃色葡萄球菌初代在高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)至36～48 h，最有利于菌落形態(tài)的觀察。(2)可疑菌落篩錯誤。從樣品的初代分離培養(yǎng)物中篩選出可疑的目標(biāo)菌需要有豐富的細(xì)菌學(xué)檢測經(jīng)驗，初代可疑菌的挑取對后續(xù)的細(xì)菌鑒定至關(guān)重要。綠膿桿菌比對項目中設(shè)置了不產(chǎn)色素菌株，金黃色葡萄球菌項目中設(shè)置了淺黃色菌落的木糖葡萄球菌作為干擾項，沙門菌項目中設(shè)置了普通變形桿菌作為干擾項，支氣管鮑特桿菌項目中設(shè)置了嗜肺巴斯德桿菌作為干擾項。當(dāng)出現(xiàn)大量非典型菌落和相似菌落的情況時有可能出現(xiàn)漏檢。(3)生化鑒定錯誤。生化鑒定是細(xì)菌鑒定的關(guān)鍵步驟。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行手工鑒定時容易造成主觀判定的誤差。當(dāng)個別生化項目與標(biāo)準(zhǔn)不符時，容易得出假陰性結(jié)論。(4)報告書寫錯誤。檢測結(jié)果準(zhǔn)確，原始記錄中編號書寫混淆導(dǎo)致最終報告錯誤。(5)未及時反饋結(jié)果。當(dāng)能力驗證樣品發(fā)樣時間有可能與高?；蚩蒲袉挝坏氖罴傧鄾_突，造成未及時對樣品進(jìn)行處理和檢測，造成結(jié)果反饋超期。

最初的從不滿意結(jié)果的原因能夠看出鑒定試劑有可能成為結(jié)果的決定。實驗動物微生物檢測試劑主要包括培養(yǎng)基、生化鑒定試劑、血清學(xué)檢測試劑等。專門用于實驗動物檢測的試劑仍然比較匱乏。現(xiàn)有這些試劑的質(zhì)量和判定標(biāo)準(zhǔn)存在一定差異。2011年的兩項檢測均為血清學(xué)方法，支原體采用ELISA方法，泰澤病原體采用ELISA或IFA方法。國內(nèi)市場上支原體和泰澤病原體的抗體檢測試劑非常少，進(jìn)口試劑往往價格昂貴，訂購周期長，很大程度上限制了檢測工作的開展。在細(xì)菌培養(yǎng)基方面，國產(chǎn)培養(yǎng)基質(zhì)量不斷提高，從比對結(jié)果和原始記錄分析，不同來源的國產(chǎn)或進(jìn)口培養(yǎng)基對分離結(jié)果的沒有顯著影響。

實驗動物細(xì)菌檢測中，對可疑菌的生化鑒定是最關(guān)鍵內(nèi)容。隨著檢測技術(shù)和檢測條件的提高，自動化鑒定設(shè)備已經(jīng)逐步應(yīng)用于檢測中。2013～2017年使用商品化鑒定試紙條或自動細(xì)菌鑒定儀的實驗室所占比例分別為30%左右，均獲得滿意結(jié)果。采用手工生化鑒定時，常因試劑反應(yīng)弱或反應(yīng)滯后造成主觀判斷錯誤。

3.5 工作展望

開展能力驗證的根本目的是為了提高實驗動物檢測機(jī)構(gòu)的能力和水平。本院開展能力驗證以來，參與單位數(shù)量從2011年的8家增加到最多時的30家，一共有45個單位參與了能力驗證工作。前幾年的實驗動物病原菌檢測能力驗證滿意率整體穩(wěn)定，并且呈穩(wěn)步升高的趨勢。隨著國內(nèi)實驗動物檢測機(jī)構(gòu)檢測水平的不斷提升，能力驗證樣品的難度設(shè)置也應(yīng)相應(yīng)增加，同時對PTP的要求也更高。雖然順利的完成了此前的能力驗證工作，但其中很多環(huán)節(jié)仍有待改進(jìn)，比如完善樣品制備工藝、增加檢測項目，豐富樣品設(shè)置等。希望在全國實驗動物工作者的共同努力和支持下，能力驗證工作能夠助力國內(nèi)實驗動物質(zhì)量檢測整體水平的進(jìn)一步提高。

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