張?jiān)?，郝新彥，?虹

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

隨著時(shí)代的發(fā)展，各類外源化合物如農(nóng)藥、獸藥、化妝品、食品添加劑、環(huán)境污染物日益增多，長期接觸這些化學(xué)物質(zhì)可導(dǎo)致人類生殖細(xì)胞損傷，生育能力下降，胚胎死亡、畸形比例上升，這一問題促使各國加強(qiáng)了對(duì)生殖毒性評(píng)價(jià)的重視[1]。生殖毒性試驗(yàn)是研究有害因素對(duì)親代生殖功能和子代生長發(fā)育造成的有害作用，是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要組成部分[2]，其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的選擇也越來越嚴(yán)格。隨著人們對(duì)小型豬研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)其性成熟時(shí)間為6個(gè)月，發(fā)情周期和妊娠期短，胎仔數(shù)量多，胚胎大，便于觀察微小畸形[3]，與人類在解剖學(xué)、生理學(xué)、疾病發(fā)生機(jī)理等方面存在一定的相似性[4-5]，是潛在的生殖毒性評(píng)價(jià)的良好動(dòng)物模型。因此，本研究對(duì)妊娠不同時(shí)期的巴馬小型豬進(jìn)行解剖，觀察孕豬的生殖功能指標(biāo)和胎仔的各項(xiàng)發(fā)育指標(biāo)，為生殖毒性研究提供正常值的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

自然受孕二胎妊娠巴馬小型豬12只，體重50.8～119.5 kg，均接種豬瘟、口蹄疫、細(xì)小、乙腦、呼吸與繁殖綜合征共5種疫苗，由北京實(shí)創(chuàng)世紀(jì)小型豬養(yǎng)殖基地提供[SCXK(京)2013-0008]。飼養(yǎng)于普通環(huán)境內(nèi)，室溫16℃～21℃，濕度60%～80%。常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境指標(biāo)控制在國標(biāo)規(guī)定的范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ILAS-GH17001。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孕豬處理

雌性巴馬小型豬分別于妊娠第30、40、50、60、70、80、90、100、112天舒泰過量麻醉處死，檢查孕豬外觀是否異常，切開腹部暴露子宮和內(nèi)臟器官，將子宮與母體分離，稱量子宮重量，取出子宮內(nèi)的胎仔，計(jì)數(shù)黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)和死胎數(shù)。稱量活胎的重量，測(cè)量活胎的身長、尾長、腦直徑，每個(gè)胎仔均進(jìn)行X光拍照。

1.2.2 胎仔檢查

觀察胎仔頭部有無露腦、腦膜膨出，眼耳口鼻外觀有無異常，上下頜有無唇裂，再進(jìn)行四肢、軀干和尾部的檢查，有無臍疝、腹裂，脊髓膨出、脊柱裂、脊柱側(cè)突等，有無短尾、卷尾、無尾等異常情況。X光拍照后將每窩一半胎仔放入Bouin’s液中固定進(jìn)行內(nèi)臟檢查，另一半胎仔用氫氧化鉀茜素紅染色進(jìn)行骨骼檢查[6]，其中妊娠112 d孕豬胎仔直接進(jìn)行大體解剖檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 孕期小型豬生殖功能指標(biāo)及胎仔生長發(fā)育指標(biāo)

在胚胎-胎仔生殖毒性試驗(yàn)中，妊娠動(dòng)物自身增強(qiáng)的毒性、胎仔生長發(fā)育及死亡情況均是該段試驗(yàn)評(píng)價(jià)的主要內(nèi)容[7]。評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括孕豬外觀和各臟器發(fā)育情況，黃體數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)和著床數(shù)，胎仔外觀發(fā)育情況，胎仔的身長、尾長等數(shù)值。各項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)見表1、表2。

表1 巴馬小型豬孕期生殖功能指標(biāo)Tab.1 Reproductive parameters of the pregnant Bama minipigs

表2 巴馬小型豬胎仔生長發(fā)育指標(biāo)Tab.2 Indexes of embryonic development of the Bama minipigs

注：(a)30 d胎仔；(b)40 d胎仔；(c)50 d胎仔；(d)60 d胎仔；(e)70 d胎仔；(f)80 d胎仔；(g)90 d胎仔；(h)100 d胎仔。圖1 巴馬小型豬胎仔外形Note.(a)A 30-day-old embryo.(b)A 40-day-old embryo.(c)A 50-day-old embryo.(d)A 60-day-old embryo.(e)A 70-day-old embryo.(f)A 80-day-old embryo.(g)A 90-day-old embryo.(h)A 100-day-old embryo.Fig.1 External appearance of Bama minipig embryos

胚胎齡(d)Embryonicages外形特征Externalfeatures30外耳出現(xiàn),視網(wǎng)膜色素明顯Aurisexternaformed,obviousretinalpigment40指(趾)分開,眼瞼閉合,性別可辨Digitsseparated,catamysis,distinguishablegender50耳豎起Earrear60蹄甲出現(xiàn)Hoofandnailformed70頭臀黑的毛色特點(diǎn)出現(xiàn)Theskinofheadandbuttockblackened80眉毛出現(xiàn)Eyebrowformed90牙齒出現(xiàn)Teethformed100外形特征發(fā)育良好Externalfeatureswelldeveloped112與成年豬的外觀特點(diǎn)一致Consistencewiththeappearanceofadultminipigs

2.2 胎仔外觀檢查

妊娠30 d小型豬胎仔性別無法分辨，妊娠40 d胎仔外觀即可分辨性別。外觀形態(tài)如圖1所示，外觀檢查結(jié)果如表3所示。

2.3 胎仔內(nèi)臟檢查

妊娠30 d的胎仔各內(nèi)臟器官初步成型，但未發(fā)育完全，妊娠40 d胎仔各內(nèi)臟器官已發(fā)育成型，可作為生殖毒性試驗(yàn)的觀察對(duì)象。固定后胎仔形態(tài)如圖2所示，內(nèi)臟檢查結(jié)果如表4所示。

2.4 胎仔骨骼檢查

妊娠30 d的胎仔骨骼未發(fā)育完全，無法用X光和骨骼染色法進(jìn)行觀察。各胎仔骨骼發(fā)育情況如圖3、表5所示。

2.5 胎仔發(fā)育情況

根據(jù)本次試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)結(jié)果，將巴馬小型豬胎仔的發(fā)育特征總結(jié)如表6所示。

表4 巴馬小型豬胎仔內(nèi)臟發(fā)育特征Tab.4 Embryonic visceral developmental characteristics of the Bama minipigs

表5 巴馬小型豬胎仔骨骼發(fā)育數(shù)量(塊)Tab.5 Indexes of embryonic skeletal development of the Bama minipigs(Block)

注：(a)30 d胎仔；(b)40 d胎仔；(c)50 d胎仔；(d)60 d胎仔；(e)70 d胎仔；(f)80 d胎仔；(g)90 d胎仔；(h)100 d胎仔。圖2 Bouin’s液固定后的巴馬小型豬胎仔Note.(a)A 30-day-old embryo.(b)A 40-day-old embryo.(c)A 50-day-old embryo.(d)A 60-day-old embryo.(e)A 70-day-old embryo.(f)A 80-day-old embryo.(g)A 90-day-old embryo.(h)A 100-day-old embryo.Fig.2 Bouin’s fluid-fixed Bama minipig embryos

胚胎齡(d)Embryonicages發(fā)育特征Developmentalcharacteristics30內(nèi)臟器官初步成型,但未發(fā)育完全,骨骼骨化不全Basicorgansformedinitially,butnotdevelopedwell40性別可辨,器官形成期結(jié)束,各內(nèi)臟器官已發(fā)育成型,軀干骨和四肢骨均可進(jìn)行肉眼觀察Genderdistinguishable,thestructureofbasicorgansweregraduallycompleted50掌骨和跖骨發(fā)育完全Metacarpusandmetatarsuswellformed60蹄甲出現(xiàn),器官組織結(jié)構(gòu)逐漸成熟,后肢趾骨全部成型Hoofandnailformed,organsdevelopedwell,phalanxformed70除腕骨和部分跗骨等較小的骨骼未成型,其他骨骼均骨化完全Boneossificationiscompleted,exceptforcarpusandtarsus80尾椎發(fā)育更加完全Tailbonedevelopedwell90胸骨發(fā)育更加完全Sternumdevelopedwell100腕骨、跗骨全部成型Carpusandtarsusformed112內(nèi)臟器官、骨骼系統(tǒng)發(fā)育完全Visceralandskeletalsystemdevelopedwell

3 討論

生殖毒性是指有害因素對(duì)親代生殖功能造成的有害作用[8]，其研究是受試物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，與急性毒性、長期毒性、遺傳毒性等毒理學(xué)研究聯(lián)系緊密。在傳統(tǒng)的三段生殖毒性試驗(yàn)中[9]，即生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)(I段)、胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)(II段)、圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)(III段)，胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)II段)是評(píng)價(jià)妊娠動(dòng)物增強(qiáng)的毒性、胚胎胎仔死亡情況、生長改變和結(jié)構(gòu)變化，此階段妊娠動(dòng)物接觸有害外來物質(zhì)將會(huì)給胎仔生長發(fā)育帶來嚴(yán)重不良影響，因此選擇合適的動(dòng)物模型對(duì)結(jié)果的判斷顯得尤為重要。試驗(yàn)通常選擇兩種動(dòng)物[10]，即嚙齒類動(dòng)物和非嚙齒類動(dòng)物，常規(guī)選用的是大鼠和家兔，但當(dāng)大鼠或家兔等傳統(tǒng)動(dòng)物不適合進(jìn)行致畸性試驗(yàn)研究時(shí)，也可采用小型豬作為替代動(dòng)物[11]。

小型豬發(fā)育毒性試驗(yàn)一般選擇在妊娠110～112 d左右處死進(jìn)行剖宮檢查[12]，但試驗(yàn)的周期過長，為了進(jìn)一步縮短試驗(yàn)的期限，有研究者對(duì)哥廷根小型豬中期(妊娠第60天)和終末(妊娠第110天)剖宮產(chǎn)檢查結(jié)果進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)中期剖宮產(chǎn)胎豬生殖器官內(nèi)部檢查可確定性別，骨骼和軟骨雙染法可檢出骨骼改變，從而表明小型豬中期剖宮產(chǎn)技術(shù)可行[13]。在小型豬胚胎發(fā)育過程中，妊娠第40天胚期結(jié)束，各臟器基本發(fā)育成型，并可分辨性別，因此本實(shí)驗(yàn)選擇在妊娠第30、40、50、60、70、80、90、100、112天處死孕豬進(jìn)行剖宮檢查，并對(duì)妊娠不同天數(shù)的巴馬小型豬胚胎的發(fā)育情況進(jìn)行觀察總結(jié)，發(fā)現(xiàn)妊娠40 d后的小型豬胎仔各內(nèi)臟器官、骨骼系統(tǒng)已發(fā)育成型，可以作為胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)的觀察對(duì)象，且小型豬的自然畸變率相對(duì)較低，可成為生殖毒性試驗(yàn)的良好動(dòng)物模型。此次研究得到這些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)可以為受試物的生殖毒性試驗(yàn)提供背景參考數(shù)據(jù)，隨著研究的不斷深入，將有更多的數(shù)據(jù)補(bǔ)充進(jìn)去，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加真實(shí)可靠。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫祖越, 周莉, 閆晗, 等. 如何成功開展藥物非臨床生殖毒性試驗(yàn) [J]. 中國新藥雜志, 2011, 20(22): 2195-2204.

[2] 周宗燦. 毒理學(xué)教程 [M]. 北京: 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2006: 238-240.

[3] Makin A. Minipigs as a non-rodent species for embryofetal development studies [C]. Meeting of the Japanese Society of Toxicology. The Japanese Society of Toxicology, 2013: 109.

[4] Bode G, Clausing P, Gervais F, et al. The utility of the minipig as an animal model in regulatory toxicology [J]. J Pharmacol Toxicol Methods, 2010, 62(3): 196-220.

[5] Vamathevan JJ, Hall MD, Hasan S, et al. Minipig and beagle animal model genomes aid species selection in pharmaceutical discovery and development [J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2013, 270(2): 149-157.

[6] 張均田, 杜冠華. 現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法 [M]. 北京: 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社, 2012.

[7] Schulz F, Batke M, Mangelsdorf I, et al. Sensitivity of different generations and developmental stages in studies on reproductive toxicity [J]. Toxicol Lett, 2014, 226(2): 245-255.

[8] 孫祖越, 周莉, 閆晗, 等. 藥物非臨床生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)中逐案原則的建議 [J]. 中國新藥雜志, 2012, 21(8): 836-843.

[9] 國家食品藥品監(jiān)督管理局. 藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則 [M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2006-2007: 143-168.

[10] Peters PW. Developmental toxicology: Adequacy of current methods [J]. Food Addit Contam, 1998, 15(Suppl): 55-62.

[11] van der Laan JW, Brightwell J, McAnulty P, et al. Regulatory acceptability of the minipig in the development of pharmaceuticals, chemicals and other products [J]. J Pharmacol Toxicol Methods, 2010, 62(3): 184-195.

[12] Svendsen O. The minipig in toxicology [J]. Exp Toxicol Pathol, 2006, 57(5-6): 335-339.

[13] 原野, 馬華智, 吳純啟. 小型豬作為生殖毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶攸c(diǎn)與優(yōu)勢(shì)分析 [J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志. 2013, 27(3): 592.