張元慧，郝新彥，高 虹

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

隨著時代的發(fā)展，各類外源化合物如農藥、獸藥、化妝品、食品添加劑、環(huán)境污染物日益增多，長期接觸這些化學物質可導致人類生殖細胞損傷，生育能力下降，胚胎死亡、畸形比例上升，這一問題促使各國加強了對生殖毒性評價的重視[1]。生殖毒性試驗是研究有害因素對親代生殖功能和子代生長發(fā)育造成的有害作用，是藥物非臨床安全性評價的重要組成部分[2]，其對實驗動物種屬的選擇也越來越嚴格。隨著人們對小型豬研究的逐漸深入，發(fā)現其性成熟時間為6個月，發(fā)情周期和妊娠期短，胎仔數量多，胚胎大，便于觀察微小畸形[3]，與人類在解剖學、生理學、疾病發(fā)生機理等方面存在一定的相似性[4-5]，是潛在的生殖毒性評價的良好動物模型。因此，本研究對妊娠不同時期的巴馬小型豬進行解剖，觀察孕豬的生殖功能指標和胎仔的各項發(fā)育指標，為生殖毒性研究提供正常值的參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

自然受孕二胎妊娠巴馬小型豬12只，體重50.8～119.5 kg，均接種豬瘟、口蹄疫、細小、乙腦、呼吸與繁殖綜合征共5種疫苗，由北京實創(chuàng)世紀小型豬養(yǎng)殖基地提供[SCXK(京)2013-0008]。飼養(yǎng)于普通環(huán)境內，室溫16℃～21℃，濕度60%～80%。常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境指標控制在國標規(guī)定的范圍內。實驗中涉及動物的操作程序已經得到中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準，批準號為ILAS-GH17001。

1.2 實驗方法

1.2.1 孕豬處理

雌性巴馬小型豬分別于妊娠第30、40、50、60、70、80、90、100、112天舒泰過量麻醉處死，檢查孕豬外觀是否異常，切開腹部暴露子宮和內臟器官，將子宮與母體分離，稱量子宮重量，取出子宮內的胎仔，計數黃體數、著床數、活胎數、吸收胎數和死胎數。稱量活胎的重量，測量活胎的身長、尾長、腦直徑，每個胎仔均進行X光拍照。

1.2.2 胎仔檢查

觀察胎仔頭部有無露腦、腦膜膨出，眼耳口鼻外觀有無異常，上下頜有無唇裂，再進行四肢、軀干和尾部的檢查，有無臍疝、腹裂，脊髓膨出、脊柱裂、脊柱側突等，有無短尾、卷尾、無尾等異常情況。X光拍照后將每窩一半胎仔放入Bouin’s液中固定進行內臟檢查，另一半胎仔用氫氧化鉀茜素紅染色進行骨骼檢查[6]，其中妊娠112 d孕豬胎仔直接進行大體解剖檢查。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 孕期小型豬生殖功能指標及胎仔生長發(fā)育指標

在胚胎-胎仔生殖毒性試驗中，妊娠動物自身增強的毒性、胎仔生長發(fā)育及死亡情況均是該段試驗評價的主要內容[7]。評價指標主要包括孕豬外觀和各臟器發(fā)育情況，黃體數、活胎數、死胎數、吸收胎數和著床數，胎仔外觀發(fā)育情況，胎仔的身長、尾長等數值。各項指標的數據見表1、表2。

表1 巴馬小型豬孕期生殖功能指標Tab.1 Reproductive parameters of the pregnant Bama minipigs

表2 巴馬小型豬胎仔生長發(fā)育指標Tab.2 Indexes of embryonic development of the Bama minipigs

注：(a)30 d胎仔；(b)40 d胎仔；(c)50 d胎仔；(d)60 d胎仔；(e)70 d胎仔；(f)80 d胎仔；(g)90 d胎仔；(h)100 d胎仔。圖1 巴馬小型豬胎仔外形Note.(a)A 30-day-old embryo.(b)A 40-day-old embryo.(c)A 50-day-old embryo.(d)A 60-day-old embryo.(e)A 70-day-old embryo.(f)A 80-day-old embryo.(g)A 90-day-old embryo.(h)A 100-day-old embryo.Fig.1 External appearance of Bama minipig embryos

胚胎齡(d)Embryonicages外形特征Externalfeatures30外耳出現,視網膜色素明顯Aurisexternaformed,obviousretinalpigment40指(趾)分開,眼瞼閉合,性別可辨Digitsseparated,catamysis,distinguishablegender50耳豎起Earrear60蹄甲出現Hoofandnailformed70頭臀黑的毛色特點出現Theskinofheadandbuttockblackened80眉毛出現Eyebrowformed90牙齒出現Teethformed100外形特征發(fā)育良好Externalfeatureswelldeveloped112與成年豬的外觀特點一致Consistencewiththeappearanceofadultminipigs

2.2 胎仔外觀檢查

妊娠30 d小型豬胎仔性別無法分辨，妊娠40 d胎仔外觀即可分辨性別。外觀形態(tài)如圖1所示，外觀檢查結果如表3所示。

2.3 胎仔內臟檢查

妊娠30 d的胎仔各內臟器官初步成型，但未發(fā)育完全，妊娠40 d胎仔各內臟器官已發(fā)育成型，可作為生殖毒性試驗的觀察對象。固定后胎仔形態(tài)如圖2所示，內臟檢查結果如表4所示。

2.4 胎仔骨骼檢查

妊娠30 d的胎仔骨骼未發(fā)育完全，無法用X光和骨骼染色法進行觀察。各胎仔骨骼發(fā)育情況如圖3、表5所示。

2.5 胎仔發(fā)育情況

根據本次試驗得到的數據結果，將巴馬小型豬胎仔的發(fā)育特征總結如表6所示。

表4 巴馬小型豬胎仔內臟發(fā)育特征Tab.4 Embryonic visceral developmental characteristics of the Bama minipigs

表5 巴馬小型豬胎仔骨骼發(fā)育數量(塊)Tab.5 Indexes of embryonic skeletal development of the Bama minipigs(Block)

注：(a)30 d胎仔；(b)40 d胎仔；(c)50 d胎仔；(d)60 d胎仔；(e)70 d胎仔；(f)80 d胎仔；(g)90 d胎仔；(h)100 d胎仔。圖2 Bouin’s液固定后的巴馬小型豬胎仔Note.(a)A 30-day-old embryo.(b)A 40-day-old embryo.(c)A 50-day-old embryo.(d)A 60-day-old embryo.(e)A 70-day-old embryo.(f)A 80-day-old embryo.(g)A 90-day-old embryo.(h)A 100-day-old embryo.Fig.2 Bouin’s fluid-fixed Bama minipig embryos

胚胎齡(d)Embryonicages發(fā)育特征Developmentalcharacteristics30內臟器官初步成型,但未發(fā)育完全,骨骼骨化不全Basicorgansformedinitially,butnotdevelopedwell40性別可辨,器官形成期結束,各內臟器官已發(fā)育成型,軀干骨和四肢骨均可進行肉眼觀察Genderdistinguishable,thestructureofbasicorgansweregraduallycompleted50掌骨和跖骨發(fā)育完全Metacarpusandmetatarsuswellformed60蹄甲出現,器官組織結構逐漸成熟,后肢趾骨全部成型Hoofandnailformed,organsdevelopedwell,phalanxformed70除腕骨和部分跗骨等較小的骨骼未成型,其他骨骼均骨化完全Boneossificationiscompleted,exceptforcarpusandtarsus80尾椎發(fā)育更加完全Tailbonedevelopedwell90胸骨發(fā)育更加完全Sternumdevelopedwell100腕骨、跗骨全部成型Carpusandtarsusformed112內臟器官、骨骼系統(tǒng)發(fā)育完全Visceralandskeletalsystemdevelopedwell

3 討論

生殖毒性是指有害因素對親代生殖功能造成的有害作用[8]，其研究是受試物非臨床安全性評價的重要內容，與急性毒性、長期毒性、遺傳毒性等毒理學研究聯(lián)系緊密。在傳統(tǒng)的三段生殖毒性試驗中[9]，即生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(I段)、胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(II段)、圍產期毒性試驗(III段)，胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗II段)是評價妊娠動物增強的毒性、胚胎胎仔死亡情況、生長改變和結構變化，此階段妊娠動物接觸有害外來物質將會給胎仔生長發(fā)育帶來嚴重不良影響，因此選擇合適的動物模型對結果的判斷顯得尤為重要。試驗通常選擇兩種動物[10]，即嚙齒類動物和非嚙齒類動物，常規(guī)選用的是大鼠和家兔，但當大鼠或家兔等傳統(tǒng)動物不適合進行致畸性試驗研究時，也可采用小型豬作為替代動物[11]。

小型豬發(fā)育毒性試驗一般選擇在妊娠110～112 d左右處死進行剖宮檢查[12]，但試驗的周期過長，為了進一步縮短試驗的期限，有研究者對哥廷根小型豬中期(妊娠第60天)和終末(妊娠第110天)剖宮產檢查結果進行了比較分析，發(fā)現中期剖宮產胎豬生殖器官內部檢查可確定性別，骨骼和軟骨雙染法可檢出骨骼改變，從而表明小型豬中期剖宮產技術可行[13]。在小型豬胚胎發(fā)育過程中，妊娠第40天胚期結束，各臟器基本發(fā)育成型，并可分辨性別，因此本實驗選擇在妊娠第30、40、50、60、70、80、90、100、112天處死孕豬進行剖宮檢查，并對妊娠不同天數的巴馬小型豬胚胎的發(fā)育情況進行觀察總結，發(fā)現妊娠40 d后的小型豬胎仔各內臟器官、骨骼系統(tǒng)已發(fā)育成型，可以作為胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗的觀察對象，且小型豬的自然畸變率相對較低，可成為生殖毒性試驗的良好動物模型。此次研究得到這些基礎數據可以為受試物的生殖毒性試驗提供背景參考數據，隨著研究的不斷深入，將有更多的數據補充進去，使實驗結果更加真實可靠。

參考文獻：

[1] 孫祖越, 周莉, 閆晗, 等. 如何成功開展藥物非臨床生殖毒性試驗 [J]. 中國新藥雜志, 2011, 20(22): 2195-2204.

[2] 周宗燦. 毒理學教程 [M]. 北京: 北京大學醫(yī)學出版社, 2006: 238-240.

[3] Makin A. Minipigs as a non-rodent species for embryofetal development studies [C]. Meeting of the Japanese Society of Toxicology. The Japanese Society of Toxicology, 2013: 109.

[4] Bode G, Clausing P, Gervais F, et al. The utility of the minipig as an animal model in regulatory toxicology [J]. J Pharmacol Toxicol Methods, 2010, 62(3): 196-220.

[5] Vamathevan JJ, Hall MD, Hasan S, et al. Minipig and beagle animal model genomes aid species selection in pharmaceutical discovery and development [J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2013, 270(2): 149-157.

[6] 張均田, 杜冠華. 現代藥理實驗方法 [M]. 北京: 中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社, 2012.

[7] Schulz F, Batke M, Mangelsdorf I, et al. Sensitivity of different generations and developmental stages in studies on reproductive toxicity [J]. Toxicol Lett, 2014, 226(2): 245-255.

[8] 孫祖越, 周莉, 閆晗, 等. 藥物非臨床生殖發(fā)育毒性試驗中逐案原則的建議 [J]. 中國新藥雜志, 2012, 21(8): 836-843.

[9] 國家食品藥品監(jiān)督管理局. 藥物生殖毒性研究技術指導原則 [M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2006-2007: 143-168.

[10] Peters PW. Developmental toxicology: Adequacy of current methods [J]. Food Addit Contam, 1998, 15(Suppl): 55-62.

[11] van der Laan JW, Brightwell J, McAnulty P, et al. Regulatory acceptability of the minipig in the development of pharmaceuticals, chemicals and other products [J]. J Pharmacol Toxicol Methods, 2010, 62(3): 184-195.

[12] Svendsen O. The minipig in toxicology [J]. Exp Toxicol Pathol, 2006, 57(5-6): 335-339.

[13] 原野, 馬華智, 吳純啟. 小型豬作為生殖毒性實驗模型的特點與優(yōu)勢分析 [J]. 中國藥理學與毒理學雜志. 2013, 27(3): 592.