李欣悅，佟 巍，張麗芳，阮研碩，叢日旭，向志光

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京 100021)

核酸檢測在實驗動物微生物質(zhì)量控制中發(fā)揮著重要作用，它可以在實驗動物感染早期檢測到病原微生物核酸，還可以持續(xù)監(jiān)測感染動物的排毒狀態(tài)[1]。小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)和呼腸孤病毒III型(reovirus 3，Reo-3)是最主要的且是最常見的嚙齒類動物感染病原體[2]，小鼠諾如病毒(murine norovirus，MNV)是實驗小鼠感染率較高的病原體[3]。這三種病毒常呈隱性感染，一定條件下才會發(fā)病，嚴重影響實驗動物健康和實驗研究。因此對實驗動物糞便或盲腸內(nèi)容物進行病毒核酸檢測是非常重要的。目前已建立實驗動物病毒核酸檢測方法，在實際應(yīng)用中采樣處理和樣品檢測步驟中間，需經(jīng)過一段時間的運輸和儲存。但實驗動物糞便或盲腸內(nèi)容物復(fù)雜，樣品的運輸或保存不當可能會影響核酸提取質(zhì)量，進而影響核酸檢測結(jié)果，特別是RNA病毒。針對病毒特性和不同類型的樣品的特點，應(yīng)確定相應(yīng)運輸溫度和核酸穩(wěn)定劑的使用。RNA提取試劑的裂解液可抑制生物樣品中的RNA酶，可以作為備選儲存劑。而在樣品運輸時較為方便的條件為藍冰運輸，該運輸溫度可維持在0℃～8℃。本研究比較了MHV，Reo-3，MNV三種病毒參考品在裂解液和生理鹽水中，在不同儲存溫度及時間等運輸條件下病毒檢出量的變化。

表1 引物和探針序列Tab.1 Primers and probe sequences

1 材料和方法

1.1 參考品的制備

MHV、Reo-3、MNV等病毒來源于the American Type Culture Collection (ATCC)，本室保存。小鼠盲腸內(nèi)容物采自-送檢至我實驗室的SPF級C57BL/6J小鼠，動物實驗在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所[SYXK(京)2014-002]進行，并獲得本單位實驗動物使用和管理委員會的批準(IACUC：XZG17001)。對盲腸內(nèi)容物應(yīng)用核酸檢測方法排除了MHV、Reo-3、MNV及國家標準須排除的病原項目。將SPF級小鼠的盲腸內(nèi)容物混合分為三組，按每0.1 g加入50 μL 50倍稀釋的病毒原液，制成三種病毒的參考品，使參考品初始病毒核酸量在104～107copies/μL范圍之間。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品分組及保存

將參考品按1∶4的比例加入 Buffer AVL，顛倒混勻10次，室溫放置2 min后，按每管200 μL分裝制成Buffer AVL 組樣品，分別置于4℃冰箱(2℃～8℃)和室溫(22℃～25℃)保存1、2、3、7、14 d。生理鹽水(normal saline, NS)組樣品以同樣的方式處理。分別于各個時間點取兩個平行樣品置-80℃保存。

1.2.2 樣品RNA提取

各時間點樣品經(jīng)12 000 r/min離心5 min后，取140 μL上清液，用QIAGEN公司病毒RNA提取試劑盒進行樣品RNA提取。

1.2.3 探針法實時熒光定量 PCR方法檢測

試劑采用Takara公司的One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit，引物和探針序列[4-5]見表1。用ABI 7500 Fast 實時PCR系統(tǒng)對各樣品進行熒光PCR分析。以1×101～1×107copies/μL的稀釋質(zhì)粒樣品制作標準曲線，計算各樣品的病毒檢出量。

1.2.4 實驗環(huán)境

所有實驗步驟均在生物安全二級(BSL-2)實驗室內(nèi)完成，其中病毒參考品的制備，樣品分組以及樣品RNA提取當中的裂解步驟均在A2型生物安全柜內(nèi)操作。

2 結(jié)果

2.1 參考品初始病毒核酸量及其在real time PCR中的 CT值

本研究以參考品0 d時檢測的病毒檢出量為基值，計算并比較各時間點樣品病毒檢出量的變化。其中MHV 參考品0 d時CT值為19.31，病毒核酸量為2×106copies/μL。Reo-3參考品0 d時CT值為25.05，病毒核酸量為5×104copies/μL。MNV參考品0 d時CT值為16.30，病毒核酸量為2.5×105copies/μL。

2.2 保存劑對核酸樣品檢出量的影響

無論是4℃還是室溫保存，生理鹽水組的參考品2 d病毒檢出量都在50%以下，遠低于buffer AVL組。其中MHV生理鹽水組1 d時已降低至15%；Reo-3生理鹽水組1 d病毒檢出量為73%，而2 d時已降低至7%，其下降幅度最為顯著，如圖1～6所示。因此，buffer AVL可以作為樣品保存劑，具有延緩RNA降解的作用。

2.3 存儲溫度對樣品檢出量的影響

4℃ buffer AVL組MHV參考品在1、2、3、7 d病毒檢出量分別降低了0%、16%、42%、76%，而室溫組樣品在1、2 d病毒檢出量分別降低了14%、69%，如圖1和圖2所示；4℃ buffer AVL組Reo-3參考品1、2、3、7 d病毒量分別降低了3%、11%、17%、50%，而室溫組樣品在1、2 d病毒檢出量分別降低了3%、40%，如圖3和圖4所示；4℃ buffer AVL組MNV參考品1、2、3、7 d病毒量分別降低了11%、16%、35%、60%，而室溫組樣品在1、2 d病毒檢出量分別降低了49%、56%，如圖5和圖6所示。Buffer AVL組樣品室溫組樣品的病毒檢出量的下降幅度明顯高于4℃組。

2.4 保藏時間對樣品核酸檢出量的影響

4℃ Buffer AVL組MHV、Reo-3、MNV三種病毒參考品在3 d時間點的病毒檢出量在50%以上，分別為58%、83%、65%；在7 d時間點仍有檢出，但已經(jīng)降低至24%、50%、40%；在14 d時間點無檢出，如圖1、圖3和圖5所示。

圖1 4℃保存盲腸內(nèi)容物樣品不同保存天數(shù)小鼠肝炎病毒核酸檢出量變化Fig.1 Changes of the amount of MHV nucleic acid in cecal content samples stored at 4℃for different days

圖2 室溫保存盲腸內(nèi)容物樣品2 d內(nèi)小鼠肝炎病毒核酸檢出量變化Fig.2 Changes of the amount of MHV nucleic acid detected in cecal content samples stored at room temperature for 2 days

圖3 4℃保存盲腸內(nèi)容物樣品不同保存天數(shù)的呼腸孤病毒III型核酸檢出量變化Fig.3 Changes of the amount of Reo-3 nucleic acid detected in the cecal content samples stored at 4℃ for different days

圖4 室溫保存盲腸內(nèi)容物樣品不同保存天數(shù)的呼腸孤病毒III型核酸檢出量變化Fig.4 Changes of the amount of Reo-3 nucleic acid detected in the cecal content samples stored at room temperature for 2 days

圖5 4℃保存盲腸內(nèi)容物樣品不同保存天數(shù)的小鼠諾如病毒核酸檢出量變化Fig.5 Changes of the amount of MNV nucleic acid detected in cecal content samples stored at 4℃ for different days

圖6 室溫保存盲腸內(nèi)容物樣品不同保存天數(shù)的小鼠諾如病毒核酸檢出量變化Fig.6 Changes of the amount of MNV nucleic acid detected in the cecal content samples stored at room temperature for 2 days

3 討論

3.1 實驗動物糞便樣品應(yīng)使用具有抑制RNA酶活性的保存劑進行運輸

實驗動物樣品從現(xiàn)場采集到樣品檢測之間存在一段運送過程。動物糞便樣品以及盲腸內(nèi)容物等樣品成分復(fù)雜，含有大量的酶類，其中包括RNA酶。而這些樣品中的病毒等檢測的靶標為病毒的核酸，極易受到樣品中RNA酶的影響而降解。因此需要盡早抑制樣品中RNA酶的活性。本研究結(jié)果表明，選擇使用RNA提取試劑中的裂解液為保存液，與生理鹽水組相比，可以提高核酸檢出率。究其原因，在于RNA提取試劑裂解液中的RNA酶抑制劑有效的抑制了內(nèi)源性的RNA酶，對核酸樣品進行了有效保護。

3.2 關(guān)于低溫運輸

4℃ Buffer AVL保存條件的三種病毒參考品的核酸量降低幅度小于室溫條件，說明低溫運輸與有利于樣品核酸的檢測。使用干冰運輸，儲存溫度接近-70℃，某種意義上對核酸樣本的保護更有利。但干冰運輸?shù)某杀据^高。在本研究中使用藍冰運輸并結(jié)合使用RNA提取試劑中的裂解液作為保護劑，在3 d時間點的病毒檢出量減少量在50%以內(nèi)，我們認為MHV、Reo-3、MNV三種病毒盲腸內(nèi)容物樣品的核酸檢測在3 d內(nèi)完成，其檢測結(jié)果較為可靠。因此，以RNA提取試劑中的裂解液為保護劑和藍冰運輸(0℃～8℃)即可基本滿足此類核酸檢測樣品短途儲運的需求，且可降低運輸成本。

3.3 核酸定量檢測方法的適用性

實驗動物病原微生物核酸檢測方法包括普通PCR以及實時熒光定量PCR等技術(shù)，其檢測的目標為微生物的核酸分子。檢測結(jié)果以檢出或未檢出進行描述，出具定性結(jié)果報告。本研究為了分析檢出量的變化采用了實時熒光定量PCR的方法。針對三種消化道病原體建立的real-time PCR檢測體系，其對低拷貝樣品的檢測下限達到10 copies/μL，(MHV 1×101copies/μL樣品CT值35.61；Reo-3 1×101copies/μL樣品CT值36.96；MNV 1×101copies/μL樣品CT值31.05，結(jié)果未顯示)，此類方法滿足實驗動物糞便樣品的檢測需求。

為了更好的測試保存和運輸條件對于核酸樣品的影響，本研究所使用的模擬樣品的起始濃度為5×104～2×106copies/μL，檢測的CT值為16.30至25.05，此樣品濃度在real-time PCR檢測方法的最佳檢測范圍內(nèi)[6],在核酸樣品濃度有限降低時(本研究中下降98%)仍可有效檢測。通過MHV、MNV感染實驗動物獲得的陽性盲腸內(nèi)容物和糞便樣品，經(jīng)real-time PCR檢測樣品CT值在20～28范圍內(nèi)[1, 7-8]，而本研究的模擬樣品與實際樣品相比其病原核酸濃度偏高，其目的在于展示儲運條件對于核酸樣品檢測的影響。

實驗動物攜帶其他病原體的樣品對儲運條件的敏感性亦可進行類似的測試。同時實驗動物病原核酸的檢測也應(yīng)該考慮核酸擴增反應(yīng)存在的其他干擾因素。

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