蔣昱楓，張 煒，李 航，張 璐

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，江蘇 蘇州 215006)

前列腺癌是一種發(fā)生于男性泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤，在歐美國(guó)家男性的發(fā)病率和死亡率較高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，前列腺癌的發(fā)病率和死亡率居歐美國(guó)家男性患者的第1位和第2位[1]。近年來，隨著老齡化問題的出現(xiàn)和人們生活方式的改變，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率逐漸上升[2-3]，嚴(yán)重威脅著男性的生命健康。研究表明，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者的5年生存率可達(dá)到100%左右，但已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者5年生存率僅為28%[4]。研究表明前列腺癌侵襲、遷移的過程受到多種癌基因的調(diào)控，但其具體的作用機(jī)制還不完全清楚。E2F轉(zhuǎn)錄因子家族包括8個(gè)成員(E2F1-8)，可活化早期區(qū)域2(E2)啟動(dòng)子，通過調(diào)控細(xì)胞周期參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化過程。核轉(zhuǎn)錄因子E2F3是E2F家族的成員之一，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等過程，從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。但在前列腺癌中關(guān)于E2F3的研究較少，因此本實(shí)驗(yàn)通過研究干擾E2F3基因表達(dá)對(duì)前列腺癌Du145細(xì)胞侵襲、遷移的影響及其可能的作用機(jī)制，以期為前列腺癌的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人前列腺癌細(xì)胞系Du145購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清、青霉素、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胰蛋白酶購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；siRNA-NC或siRNA-E2F3購(gòu)自上海吉瑪有限公司；E2F3抗體、鈣黏蛋白E(E-cadherin)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease-9, MMP-9)抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司；β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

前列腺癌細(xì)胞Du145置于RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入10%的胎牛血清、青霉素和鏈霉素，確保細(xì)胞培養(yǎng)過程的無菌性，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞

轉(zhuǎn)染前24 h，取對(duì)數(shù)期Du145細(xì)胞接種于24孔板上，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度達(dá)到90%～95%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。棄去完全培養(yǎng)基，加入400 μL Opti-MEM培養(yǎng)基。0.8 μg siRNA-NC或siRNA-E2F3與50 μL LipofectamineTM2000混合均勻，37℃結(jié)合20 min，將形成的siRNA-E2F3-LipofectamineTM2000復(fù)合物加入24孔板中，培養(yǎng)6～8 h，將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組，Du145 NC組，Du145-siRNA組，蛋白質(zhì)印跡法(western blot)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力

取8×105個(gè)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種到6孔板中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到90%左右，200 μL消毒槍頭劃線，棄去液體，更換為不含血清的培養(yǎng)基，ImageJ 1.48軟件觀察細(xì)胞0、48 h的劃痕距離，根據(jù)0、48 h劃痕距離計(jì)算細(xì)胞的劃痕愈合率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力

實(shí)驗(yàn)前，稀釋Matrigel膠，每1 cm2Transwell小室加入200 μL Matrigel膠，37℃通風(fēng)30 min備用。細(xì)胞饑餓處理24 h，0.25%胰酶消化，離心，不含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種到Transwell小室上室中，下室中加入500 μL含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基(作為趨化因子)，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24 h，棉簽擦去小室中未穿過濾膜的細(xì)胞，1%甲醇固定，蘇木精染色，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量，每組5個(gè)復(fù)孔，取平均值代表侵襲數(shù)目。

1.3.5 Western Blot檢測(cè)E-cadherin、MMP-9蛋白的表達(dá)

離心，收集細(xì)胞，PBS緩沖液清洗2次，加入200 μL RIPA細(xì)胞裂解液，在冰上冷卻30 min，12 000 r/min離心20 min，取上清至一無菌的Ep管中，按BAC試劑說明書進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取100 μL蛋白提取液加入5 μL溴酚藍(lán)混合均勻，置于沸水中煮沸10 min。配置10%的分離膠和5%的積層膠，加入20 μg樣品蛋白，70 V電泳直至蛋白質(zhì)進(jìn)入積層膠，將電壓調(diào)整至100 V，電泳至溴酚藍(lán)到分離膠底部。切除多余凝膠，在轉(zhuǎn)移盒中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至甲醇浸泡的PVDF膜上。將帶有目的條帶的PVDF膜置于 5%脫脂牛奶封閉1～1.5 h，棄去封閉液。加入一抗，4℃孵育過夜，加入25 mL TBST清洗3次，每次10 min，加入二抗，室溫下結(jié)合45 min，加入25 mL TBST清洗3次，每次15 min。加入化學(xué)發(fā)光劑，反應(yīng)1 min，暗室中曝光1 min，以β-actin為內(nèi)參，凝膠成像儀掃描蛋白質(zhì)的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中E2F3蛋白的表達(dá)量

結(jié)果如圖1、表1所示，轉(zhuǎn)染siRNA-E2F3后，前列腺癌Du145細(xì)胞中E2F3蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降(t=7.526，P< 0.01)，Du145 NC組細(xì)胞中E2F3蛋白的表達(dá)量差異無顯著性(P> 0.05)。

圖1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中E2F3蛋白的表達(dá)量Fig.1 Expression of E2F3 protein in the transfected cells

組別GroupsE2F3蛋白相對(duì)表達(dá)量RelativeexpressionofE2F3protein對(duì)照組Controlgroup0.652±0.083Du145NC組Du145NCgroup0.587±0.064Du145-siRNA組Du145-siRNAgroup0.243±0.048*F32.716P0.001

注：與對(duì)照組相比，*P< 0.01。

Note.Compared with the control group，*P< 0.01.

2.2 干擾E2F3基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

結(jié)果如表2所示，Du145-siRNA組細(xì)胞劃痕愈合率較對(duì)照組明顯下降(t=5.335，P< 0.01)；與對(duì)照組相比，Du145 NC組細(xì)胞劃痕愈合率差異無顯著性(P> 0.05)。說明沉默E2F3表達(dá)后降低了前列腺癌細(xì)胞的遷移能力。

2.3 干擾E2F3基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

結(jié)果如表3所示，Du145-siRNA組細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著低于對(duì)照組(t=4.133,P< 0.01)；Du145 NC組細(xì)胞侵襲數(shù)目較對(duì)照組差異無顯著性(P> 0.05)。說明沉默E2F3表達(dá)后降低了前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力。

表2 干擾E2F3基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響Tab.2 Effect of interference of E2F3 gene expression on the cell migration ability

注：與對(duì)照組相比，*P< 0.01。

Note.Compared with the control group，*P< 0.01.

表3 干擾E2F3基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響Tab.3 Effect of interference of E2F3 gene expression on the cell invasiveness

注：與對(duì)照組相比，*P< 0.01。

Note.Compared with the control group，*P< 0.01.

2.4 干擾E2F3基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞E-cadherin、MMP-9蛋白的表達(dá)的影響

結(jié)果如表4、圖2所示，與對(duì)照組相比，Du145-siRNA組細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)量顯著升高(t=9.887，P< 0.01)，MMP-9蛋白的表達(dá)量顯著下降(t=8.362，P< 0.01)；對(duì)照組和Du145 NC組中E-cadherin、MMP-9的表達(dá)無顯著性差異(P> 0.05)。

圖2 干擾E2F3基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞E-cadherin、MMP-9蛋白的表達(dá)的影響Fig.2 Effect of interference of E2F3 gene expression on the expression of E-cadherin and MMP-9 proteins in the cells

表4 干擾E2F3基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞E-cadherin、MMP-9蛋白的表達(dá)的影響Tab.4 Effect of interference of E2F3 gene expression on the expression of E-cadherin and MMP-9 proteins in the cells

注：與對(duì)照組相比，*P< 0.01。

Note.Compared with the control group，*P< 0.01.

3 討論

前列腺癌是一種男性常見的惡性腫瘤，在美國(guó)、歐洲等國(guó)家的發(fā)病率較高[6]。前列腺癌發(fā)生與多種因素相關(guān)，比如飲食習(xí)慣的改變、年齡的增長(zhǎng)均可誘發(fā)前列腺癌[7]。目前，前列腺癌常用的治療方式有內(nèi)分泌治療、手術(shù)、放化療等[8]。但大部分前列腺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，喪失了內(nèi)分泌治療、手術(shù)等根治性治療的機(jī)會(huì)[9]?；瘜W(xué)藥物治療易產(chǎn)生耐藥性，放射治療易產(chǎn)生毒副作用，因此尋找抑制前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)具有重要意義。E2F3在前列腺癌組織中的表達(dá)量高于良性前列腺組織，其表達(dá)量隨著臨床分期和病理惡性程度的進(jìn)展而逐漸升高，提示E2F3基因參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，其表達(dá)量增加表明腫瘤的惡性程度和侵襲、遷移性較高[10]。本研究通過siRNA技術(shù)沉默前列腺癌細(xì)胞中E2F3的表達(dá)；細(xì)胞劃痕和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)表明，干擾E2F3基因表達(dá)后，Du145細(xì)胞的侵襲、遷移能力顯著降低。因此，在前列腺癌的分子靶向治療中，E2F3可作為一個(gè)重要的基因靶點(diǎn)。

E-cadherin是鈣粘素家族的成員之一，不僅維持細(xì)胞間的物理性連接，還對(duì)上皮細(xì)胞特性的保持具有重要作用[11]。E-cadherin丟失使上皮細(xì)胞間的極性和粘附能力丟失，呈現(xiàn)非上皮細(xì)胞的特性。E-cadherin的表達(dá)量降低，會(huì)使細(xì)胞間的粘附能力降低，細(xì)胞易發(fā)生脫落[12]。研究表明E-cadherin的表達(dá)量與多種腫瘤的分化程度呈現(xiàn)正相關(guān)，參與腫瘤的侵襲、遷移過程[13-15]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotease, MMPs)是一類鋅依賴性內(nèi)切酶，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，其表達(dá)量上調(diào)可增強(qiáng)多種癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力[16]。MMP-9是MMPs家族的重要成員，有研究認(rèn)為MMP-9與腫瘤的侵襲、遷移能力關(guān)系最密切和直接[17]。既往研究表明MMP-9的表達(dá)量與前列腺癌病理學(xué)分級(jí)和臨床分期具有相關(guān)性，參與前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程[18-19]。本研究結(jié)果表明，干預(yù)E2F3表達(dá)可下調(diào)前列腺癌細(xì)胞中MMP-9蛋白的表達(dá)水平，上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)水平。提示干預(yù)E2F3表達(dá)可能通過降低MMP-9表達(dá)，增加E-cadherin表達(dá)而降低前列腺癌Du145細(xì)胞的侵襲、遷移能力。

綜上所述，干預(yù)E2F3表達(dá)可能通過調(diào)控MMP-9蛋白和E-cadherin蛋白表達(dá)參與前列腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移過程， 提示 E2F3可作為治療前列腺癌轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)。

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