施佳君，陳方明，馬全鑫，陳 誠，陳姣姣，郁 晨，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學比較醫(yī)學研究所動物實驗研究中心，杭州 310053)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、炎癥性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，其主要的病理學特征為關(guān)節(jié)滑膜組織增生以及骨、軟骨等結(jié)構(gòu)進行性病變，最終導致關(guān)節(jié)畸形，功能喪失，嚴重影響人們的生活質(zhì)量[1]。動物模型是研究RA發(fā)病機制和防治方法的重要環(huán)節(jié)。牛II型膠原誘導嚙齒類動物形成膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)為常用的RA模型，尤其在藥效學評價研究中大鼠CIA模型使用最多，國際上大多使用Lewis大鼠造模[2-3]，而國內(nèi)大多用Wistar大鼠造模[4-5]。我們在前期研究工作中雖也發(fā)現(xiàn)Lewis大鼠和Wistar大鼠在成模率和對膠原的敏感性上有差異，但這兩種模型在病癥表現(xiàn)和病理特點上的差異尚不清楚。為此，本研究對膠原誘導的Wistar和Lewis大鼠RA模型的病癥病理特點進行了比較研究，為大鼠RA模型動物的選擇應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠與Lewis大鼠各16只，體重為(170±10)g，購自北京維通利華實驗動物有限公司[SCXK(京)2012-0001]；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心屏障環(huán)境實驗室[SYXK(浙)2013-0184]；環(huán)境溫度(23±1)℃；相對濕度50%～65%；光照12 h明暗交替(早7:30～晚19:30)；噪音：<50 dB。大鼠飼養(yǎng)于IVC中，每籠3只飼養(yǎng)，自由飲食；試驗期間，遵循3R原則給予實驗動物人道主義關(guān)懷，福利倫理審查證號[ZSLL-2016-84]。

1.2 主要試劑及儀器

牛II型膠原(CII)(20021)購自Chondrex公司；弗氏完全佐劑(CFA)(F5881)、弗氏不完全佐劑(IFA)(F5506)、一抗VEGF(sc-7269)等購自Santa Cruz公司；IL-6(ab9324)、IL-10(ab33471)和IL-17(ab214588)等購自Abcam公司；二抗：PV-8000通用型二抗試劑盒(含DAB顯色液)購自中杉金橋公司；HRP標記兔抗大鼠二抗(BA1058)購自BOSTER公司；TMB底物溶液(J644)購自Amresco公司；蘇木色精(M0820)購自上海伯奧生物科技有限公司；曙紅Y水溶(71014544)購自國藥集團化學試劑有限公司。

YLS-7C足趾容積測量儀(山東濟南益延科技有限公司)；電子數(shù)顯游標卡尺(Exploit公司)；多功能酶標儀(賽默飛世爾科技公司)； PLX7000B高頻C臂X射線系統(tǒng)(南京Perlove醫(yī)療設備公司)；ASP200S全自動脫水機(Leica公司)；AP280-2包埋機(Microm公司)；半自動切片機(Leica公司)；NanoZoomer數(shù)字切片掃描儀(濱松光子公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫原的制備

4℃無菌條件下，將CII凍干粉溶解于0.05 mol/L乙酸溶液中，配制濃度為2 mg/mL，與等體積的CFA或IFA充分混勻乳化(即每1 mL含1 mg CII)，采用注射器雙推20 min，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 動物分組與造模

取Lewis和Wistar大鼠各6只為Lewis正常對照組、Wistar正常對照組，其余各10只尾根部皮內(nèi)注射CII和CFA的1∶1乳化混合液進行首次免疫，其中，Lewis大鼠每只注射0.3 mL，Wistar大鼠每只注射0.4 mL；第14天加強免疫，均注射CII和IFA的1∶1乳化混合液每只0.2 mL，建立Lewis-RA模型和Wistar-RA模型，即為Lewis-RA組和Wistar-RA組。每日觀察各組的發(fā)病情況，每周測定各組大鼠足腫脹程度，每隔3周評估關(guān)節(jié)炎指數(shù)，并測定關(guān)節(jié)炎血清抗CII抗體效價，第12周時進行X射線檢查和組織病理學觀察。

1.3.3 一般情況觀察

觀察各組大鼠的行為活動、精神狀態(tài)、發(fā)病等情況，并記錄發(fā)病時間和發(fā)病數(shù)量計算發(fā)病率。

1.3.4 關(guān)節(jié)腫脹和變形情況觀察

1.3.5 病理學觀察

觀察結(jié)束后，各組大鼠實施過量麻醉安死術(shù)，沿后肢正中縱行切開皮膚直至暴露出膝關(guān)節(jié)，從膝關(guān)節(jié)囊上緣向上1 cm處剪斷下肢，分離剝除肌肉，迅速放入福爾馬林固定。固定72 h后，關(guān)節(jié)置10%甲酸中脫鈣4周，待針刺骨組織無阻力感時即為脫鈣完成，進行常規(guī)的脫水包埋后切成4 μm的薄片，行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察其病理變化。

1.3.6 免疫學相關(guān)指標的測定

每隔3周，眼眶取血0.6 mL，3000 r/min離心10 min，取其上清，-80℃冰箱保存，用于檢測血清中抗CII抗體效價。

采用免疫組化染色方法檢測踝關(guān)節(jié)相關(guān)免疫因子的表達。蠟塊切成4 μm的薄片，60℃烘烤2 h，脫蠟，水洗，經(jīng)高壓修復后用3%的過氧化氫溶液封閉10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，然后滴加VEGF、IL-6、IL-10和IL-17抗體稀釋液于4℃孵育過夜，經(jīng)PBS沖洗后滴加二抗，37℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復染，透明后封片。目標蛋白被標記為棕黃色。用NanoZoomer數(shù)字切片掃描儀掃描切片，并用圖像軟件截取20×的照片，用IPP6.0軟件分析其陽性表達光密度(IOD)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 一般觀察情況

Lewis和Wistar大鼠的正常對照組均飲食正常，精神狀態(tài)良好，動作敏捷，四肢有力。Wistar-RA組有8只大鼠在首次免疫后第10天出現(xiàn)活動減少，精神萎靡，毛發(fā)粗亂，輕微脫毛，足掌部腫脹明顯，第21天腫脹達到高峰，隨后腫脹緩慢消退并從第5周進入平緩期，其余2只未見足掌腫脹，Wistar-RA組的成模率為80%。Lewis-RA組10只大鼠均在首次免疫后第14天出現(xiàn)腳掌和踝關(guān)節(jié)腫脹，第24天腫脹達到高峰，隨后腫脹消退，第8周進入平緩期，Lewis-RA組的成模率為100%，且腳趾和關(guān)節(jié)變形嚴重，尾部有結(jié)痂。由表1可見，第3周、6周、9周、12周時Wistar-RA組和Lewis-RA組關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著升高(P< 0.01)，第6周后Lewis-RA組關(guān)節(jié)炎指數(shù)均高于Wistar-RA組(P< 0.05)，且隨時間的延長，個體差異減少。

2.2 足容積和足掌厚度

由圖1顯示，與Lewis正常對照組比較，Lewis-RA組首次免疫后第2周至12周足容積、足掌厚度和足容積增長率、足掌厚度增長率均顯著增加(P< 0.01)，足容積曲線和足容積增長率曲線在第3周達到高峰，隨后曲線逐漸下降，第8周后曲線變平；足掌厚度曲線和足掌厚度增長率曲線也在第3周達到高峰，隨后曲線下降，在第7周后曲線變平。而圖2顯示，與Wistar正常對照組比較，Wistar-RA組第2周至12周足容積、足掌厚度和足容積增長率、足掌厚度增長率均顯著增加(P< 0.01)，且足容積曲線、足掌厚度曲線和足容積增長率曲線、足掌厚度增長率曲線均在第3周達到高峰，在第5周后曲線變平。

2.3 血清抗CII抗體效價水平

由圖3可見，與正常對照組比較，Wistar-RA組和Lewis-RA組血清抗CII抗體效價均顯著升高(P< 0.01)；與Wistar-RA組比較，首次免疫后6周、9周和12周時Lewis-RA組血清抗CII抗體效價均明顯低于Wistar-RA組大鼠(P< 0.01)。

表1 Wistar和Lewis大鼠RA模型關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評分比較Tab.1 Comparison of arthritis indexes (AI) between the Wistar and Lewis rat RA models

注：與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Wistar-RA組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note.Compared with the control group，#P<0.05，##P<0.01.Compared with the Wistar-RA group，*P<0.05，**P<0.01.

圖1 Lewis大鼠足容積和足掌厚度Fig.1 The paw volume and paw thickness of the Lewis rats

圖2 Wistar大鼠足容積和足掌厚度Fig.2 The paw volume and paw thickness of the Wistar rats

注：與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Wistar-RA組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖3 血清抗CII效價抗體水平Note.Compared with the control group，#P<0.05，##P<0.01；Compared with the Wistar-RA group，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.3 Serum anti-CII antibody titers in the rats

2.4 后肢足關(guān)節(jié)形態(tài)和骨密度

由圖4后肢X光片檢查結(jié)果顯示，Lewis和Wistar大鼠的正常對照組關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整清楚，足趾各關(guān)節(jié)空隙清晰，均未見踝關(guān)節(jié)軟組織腫脹。Lewis-RA組和Wistar-RA組均出現(xiàn)踝關(guān)節(jié)軟組織腫脹，足趾各關(guān)節(jié)空隙狹窄且模糊，關(guān)節(jié)變形等病變。與Wistar-RA組比較，Lewis-RA組的足趾關(guān)節(jié)腫脹和骨質(zhì)損傷更嚴重。圖5X光片的骨密度分析結(jié)果顯示，與正常對照組相比Lewis-RA組和Wistar-RA組股骨和脛骨骨密度均明顯降低(P< 0.01)，但兩模型組之間差異無顯著性(P>0.05)。

注：A：Wistar正常對照組；B：Wistar-RA組；C：Lewis正常對照組；D：Lewis-RA組；“→”表示腫脹變形嚴重。圖4 后肢足關(guān)節(jié)形態(tài)Note.A：Wistar control group.B：Wistar-RA group.C：Lewis control group.D：Lewis-RA group.“→” indicates serious swelling and deformation.Fig.4 Radiological images of the rat hind limb joints

注：與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Wistar-RA組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 后肢骨密度分析Note.Compared with the control group，#P<0.05，##P<0.01.Compared with the Wistar-RA group，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.5 Analysis of the bone mineral density of the rat hind limbs

2.5 踝關(guān)節(jié)常規(guī)病理組織學觀察

HE染色結(jié)果顯示，Lewis和Wistar正常對照組大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)清晰，脂肪性滑膜和纖維性滑膜未見明顯增生，軟骨完整，未見炎癥細胞浸潤。兩模型均出現(xiàn)軟骨侵蝕，滑膜增生，大量炎癥細胞浸潤，破骨細胞增多，侵蝕、溶解全層骨組織，并有血管翳形成。與Wistar-RA組比較，Lewis-RA組軟骨層破壞更嚴重、血管翳形成更多(圖6)。

2.6 關(guān)節(jié)滑膜細胞因子的表達

免疫組化顯示，與Wistar和Lewis大鼠的正常對照組比較，Wistar-RA組和Lewis-RA組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中VEGF、IL-6、IL-17A的表達顯著增加(P< 0.05，P< 0.01)，IL-10表達明顯降低(P< 0.01)。與Wistar-RA組比較，Lewis-RA組VEGF表達顯著高于Wistar-RA組(P< 0.05)，IL-17A則顯著低于Wistar-RA組(P< 0.05)，而IL-6、IL-10的表達則無明顯差異(P>0.05)(圖7、圖8)。

3 討論

牛II型膠原(CII)誘導大鼠RA模型中，常用造模的首次免疫劑量為每只0.2～0.4 mg[7-8]，加強免疫劑量為每只0.2 mg，其中，Lewis大鼠造模的首次免疫劑量以每只0.2 mg或0.4 mg居多[9-10]，而Wistar大鼠造模的首次免疫劑量以每只0.4 mg居多[5,11]。我們前期研究曾在Lewis大鼠造模中使用CII首次免疫注射劑量每只0.4 mg，發(fā)現(xiàn)免疫后注射部位尾根部出現(xiàn)潰爛斷裂。本實驗中，將Lewis大鼠造模的CII首次免疫劑量改為每只0.3 mg，雖也出現(xiàn)尾部有結(jié)痂，但未見尾根部潰爛斷裂；Lewis大鼠首次免疫后第14天出現(xiàn)腫脹，第24天達到高峰，隨后腫脹逐漸消退，第7周進入平緩期，其成模率為100%，與文獻描述一致[12]；Wistar大鼠造模使用CII的首次免疫劑量為每只0.4 mg，首次免疫后分別在第10天出現(xiàn)腫脹，第21天達到高峰，隨后腫脹消退，第5周進入平緩期，成模率80%。足容積、足掌厚度測定結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，Wistar-RA組和Lewis-RA組足容積、足掌厚度均在第3周達到高峰，隨后逐漸下降，Wistar-RA組的足容積、足掌厚度在第5周后穩(wěn)定在一定程度，而Lewis-RA組足容積、足掌厚度分別在第8周和第7周后穩(wěn)定在一定程度，與Wistar-RA組比，Lewis-RA組的關(guān)節(jié)腫脹持續(xù)時間長2～3周。說明CII誘導后，Wistar大鼠腫脹出現(xiàn)快，但消退也快，腫脹的持續(xù)時間較短；而Lewis大鼠腫脹出現(xiàn)慢，但消退更慢，腫脹的持續(xù)時間長。且AI評分結(jié)果顯示，Lewis-RA組AI第6周后明顯高于Wistar-RA組，說明Lewis-RA組的關(guān)節(jié)損傷程度大于Wistar-RA組，這可能與Lewis-RA的關(guān)節(jié)腫脹的持續(xù)時間有關(guān)。

注：與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Wistar-RA組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖7 關(guān)節(jié)滑膜VEGF、IL-6、IL-10、IL-17A的表達Note.Compared with the control group，#P<0.05，##P<0.01.Compared with the Wistar-RA group，*P<0.05，**P<0.01.Fig.7 Expression of VEGF, IL-6, IL-10, IL-17A in the synovial tissues

圖8 踝關(guān)節(jié)VEGF、IL-6、IL-17A、IL-10免疫組化結(jié)果(Bar=250 μm)Fig.8 Expression of VEGF, IL-6, IL-17A and IL-10 in the ankle tissues. Immunohistochemical staining

類風濕關(guān)節(jié)炎會導致關(guān)節(jié)軟骨、骨組織結(jié)構(gòu)破壞以及功能障礙，也是繼發(fā)骨質(zhì)疏松的重要原因[13]。后肢X光片檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lewis-RA組和Wistar-RA組均出現(xiàn)踝關(guān)節(jié)軟組織腫脹，足趾各關(guān)節(jié)空隙狹窄且模糊，關(guān)節(jié)變形等病變。但Lewis-RA組的足趾關(guān)節(jié)腫脹和骨質(zhì)損傷更嚴重。且對X光片的骨密度分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lewis-RA組和Wistar-RA組股骨和脛骨骨密度均明顯降低(P< 0.01)，說明Lewis-RA和Wistar-RA已出現(xiàn)了骨質(zhì)疏松的癥狀。組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)，Wistar-RA組和Lewis-RA組大鼠踝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)了滑膜增生、血管翳形成，軟骨破壞和骨侵蝕等典型的RA癥狀，且Lewis-RA組大鼠的軟骨破壞更嚴重，血管新生和滑膜血管翳形成更多，這說明Lewis大鼠的關(guān)節(jié)損傷更為嚴重。

CII抗體免疫應答與RA關(guān)節(jié)的系統(tǒng)性受累以及持續(xù)的慢性發(fā)展有著緊密聯(lián)系。本實驗結(jié)果顯示Lewis-RA組大鼠的血清抗CII抗體效價低于Wistar-RA組大鼠，這可能與Lewis大鼠CII的首次免疫劑量低于Wistar大鼠有關(guān)。然而從發(fā)病率來看，X光片和組織病理學觀察結(jié)果表明Lewis大鼠的關(guān)節(jié)損傷更嚴重，這可能與Lewis大鼠自身遺傳的生理特性有關(guān)。Lewis大鼠先天的下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸功能低下[14-15]，免疫亢進，易感類風濕關(guān)節(jié)炎和實驗性腦脊髓炎等自身免疫性疾病[16]，說明Lewis大鼠更易誘導形成類風濕關(guān)節(jié)炎模型。

慢性炎癥反應是RA的主要發(fā)病機制，淋巴細胞浸潤及其分泌促炎因子和抗炎因子之間的相互作用和調(diào)節(jié)，形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，控制著關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展[17]。IL-17A是具有強大致炎作用的促炎細胞因子，能促進成纖維細胞分泌IL-6、IL-8、GM-CSF等炎癥因子，并能刺激破骨細胞分化和活化，是導致滑膜炎癥、骨破壞的重要因素[18-19]。IL-6在骨的新陳代謝中誘導破骨細胞前體分化成真正的破骨細胞，是進一步破壞骨和軟骨的主要因素，IL-6水平與慢性滑膜炎的局部關(guān)節(jié)癥狀及關(guān)節(jié)破壞的嚴重程度密切相關(guān)[20]。IL-6可提高VEGF的水平，VEGF作為血管新生的重要誘導劑，對RA滑膜炎癥和滑膜血管翳的形成具有重要作用[21]。IL-10是一種抗炎性因子，在類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起一定作用，中和IL-10后關(guān)節(jié)炎加重[22]。本實驗結(jié)果顯示，Wistar-RA組和Lewis-RA組踝關(guān)節(jié)滑膜中VEGF、IL-6、IL-17A的表達顯著增加，而IL-10表達明顯降低，表明在Wistar-RA模型和Lewis-RA模型的病理過程與VEGF、IL-6、IL-17A和IL-10的表達密切相關(guān)。實驗結(jié)果還顯示，Lewis-RA組關(guān)節(jié)滑膜IL-17A表達低于Wistar-RA組，而VEGF表達則高于Wistar-RA組，提示W(wǎng)istar-RA模型中IL-17A的促炎作用更強，而Lewis-RA模型關(guān)節(jié)滑膜血管新生和血管翳形成更明顯，可能是與VEGF的高表達有關(guān)。

RA是一種自身免疫性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、變形，其病理是以滑膜持續(xù)炎癥，骨骼破壞及軟骨降解為特征[23]。炎癥細胞因子激活破骨細胞是局部骨破壞的重要原因之一[24]。本實驗通過CII誘導建立大鼠RA模型，均出現(xiàn)了關(guān)節(jié)腫脹、變形，活動減少等癥狀，關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高，關(guān)節(jié)滑膜中VEGF、IL-6、IL-17A的表達增加，IL-10表達下降，與臨床的癥狀表現(xiàn)和病理機制相符。但Wistar大鼠模型和Lewis大鼠模型的病程、病癥和病理特點存在一定的差異。Wistar大鼠膠原誘導后腫脹出現(xiàn)快，但腫脹的持續(xù)時間較短；而Lewis大鼠膠原誘導后腫脹出現(xiàn)慢，但腫脹的持續(xù)時間長，Wistar大鼠造模價格便宜，但成模率低，而Lewis大鼠價格高，但成模率100%，且關(guān)節(jié)損傷更為嚴重、血管新生和血管翳形成更明顯。因此，對這兩種模型的選擇需要根據(jù)其不同的病征特點以及實驗目的綜合考慮而定。

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