劉 明，邱 彬，王婷婷，鄧 然，劉云波，雍偉東

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

肥胖已成為世界性的流行性疾病，并呈急劇上升趨勢(shì)，是糖尿病、心血管疾病及某些癌癥發(fā)生的危險(xiǎn)因素。肥胖是生物體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)多的狀態(tài)，現(xiàn)代人長(zhǎng)期高熱量食物的飲食方式、久坐不動(dòng)的生活方式以及遺傳易感性都可能會(huì)擾亂脂代謝穩(wěn)態(tài)的平衡，造成脂代謝紊亂和有關(guān)器官的病理生理變化，引發(fā)肥胖、脂肪肝、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等多種代謝性疾病，因此對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)控成為肥胖研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[1-3]。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)之一，是檸檬酸循環(huán)及氧化磷酸化進(jìn)行的重要場(chǎng)所，有細(xì)胞“能量工廠”之稱[4]。目前的研究表明，線粒體作為細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化的核心細(xì)胞器，是脂肪酸氧化的主要場(chǎng)所，對(duì)于維持體內(nèi)能量平衡尤為重要。慢性脂質(zhì)積累將增強(qiáng)線粒體脂肪酸氧化率，增加活性氧的生成[5]。脂質(zhì)攝取過(guò)量將導(dǎo)致脂肪在脂肪組織以外的組織中發(fā)生異位沉積，在這些組織中存儲(chǔ)的多余脂肪大多經(jīng)無(wú)氧途徑產(chǎn)生有毒的脂質(zhì)中間體，引起線粒體功能障礙及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力升高，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。機(jī)體還可在NADPH氧化酶類(lèi)和其他助氧化劑酶的催化下產(chǎn)生非線粒體來(lái)源的活性氧[4]。過(guò)多的活性氧，不僅造成線粒體功能受損，還會(huì)造成線粒體形態(tài)的變化。線粒體形態(tài)受其融合及裂變的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)，這一過(guò)程主要受線粒體融合蛋白MFN1和MFN2等蛋白的調(diào)控，介導(dǎo)線粒體在細(xì)胞中的重新分布以及受損線粒體的恢復(fù)。最近研究者證實(shí)，在肥胖癥模型Zucker大鼠中，線粒體形態(tài)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為線粒體表面積明顯增大而體積減少，表明肥胖癥中骨骼肌線粒體個(gè)體更小、線粒體網(wǎng)絡(luò)更細(xì)碎[6]。以上研究表明高脂誘導(dǎo)線粒體形態(tài)功能變化，從而影響線粒體脂肪酸代謝，增加脂滴積累。

FKBP51是一種具有肽酰脯氨酰順-反異構(gòu)酶活性的免疫親和蛋白，它含有的肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的相互作用。作為一種共伴侶蛋白，它能直接與HSP90等伴侶蛋白結(jié)合參與激素-受體復(fù)合物的形成及調(diào)控[7]。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，禁食情況下小鼠下丘腦中FKBP51的高表達(dá)能夠減少糖皮質(zhì)激素的負(fù)反饋，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素水平升高，從而促進(jìn)肥胖的發(fā)生[8]。此外，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，敲除FKBP51能夠通過(guò)調(diào)節(jié)PPARγ活性，抑制脂肪細(xì)胞的分化合成，抵制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)脂肪積累[9]。以上證據(jù)都表明FKBP51在脂肪形成和分化中具有重要作用。最新的研究表明，在脂肪分化過(guò)程中，F(xiàn)KBP51能夠在PKA信號(hào)通路的調(diào)控下穿梭于細(xì)胞核-線粒體之間，從而影響基因的表達(dá)[10]。

因此，我們推測(cè)FKBP51可能通過(guò)影響線粒體的形態(tài)與功能，調(diào)節(jié)高脂誘導(dǎo)下的體內(nèi)脂肪分化和積累，對(duì)抗肥胖的發(fā)生。本研究利用高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠模型，探討高脂飲食條件下，F(xiàn)KBP51基因?qū)€粒體形態(tài)與功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性C57BL/6J小鼠12只，4周齡，體重9～11 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]。小鼠隨機(jī)分為兩組：正常飲食組(RD)和高脂飲食組(HF)，每組6只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[SYXK(京)2011-0022]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ILAS-PG-2014-013。

1.2 主要試劑和儀器

高脂飼料(60 kcal% fat，D12492)購(gòu)自美國(guó)Research Diets公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；線粒體提取試劑盒(89801)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物科技有限公司；COXIV、MITOFUSIN、PHB1和FKBP51抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。使用比例均為抗體：稀釋液=1∶1000。

電子天平(精度0.01 g，上海民橋電子天平廠)；石蠟切片機(jī)(IVS-401，日本Sakura Finetek公司)；光學(xué)顯微鏡(BX50，日本Olympus公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5500，中國(guó)天能公司)；透射電鏡(JEM-1400，日本JEOL公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高脂誘導(dǎo)肥胖表型的建立

小鼠4周齡時(shí)分別進(jìn)行正常飲食和高脂喂養(yǎng)，每周稱量并記錄小鼠體重1次，連續(xù)記錄六周。小鼠脫頸處死后迅速取出肝臟組織，用10%中性福爾馬林固定，經(jīng)石蠟包埋后以4 μm厚度切片，隨后進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 RNA測(cè)序及差異基因的GO本體分析

小鼠脫頸處死后在冰上迅速取出肝臟組織，利用Trizol法提取RNA，并將樣品交由華大基因測(cè)序，使用DEGseq軟件[11]進(jìn)行差異基因分析，限定P值后獲得差異基因列表。通過(guò)在線工具DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)，利用基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)(GO)將功能相同的基因聚類(lèi)到一個(gè)單元，在細(xì)胞成分上對(duì)差異基因進(jìn)行注釋，并對(duì)其中線粒體相關(guān)基因功能進(jìn)行分析。

1.3.3 差異基因的KEGG通路分析

利用全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)(KEGG)對(duì)同一通路的差異基因進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.3.4 電鏡觀察線粒體形態(tài)

小鼠脫頸處死后于手術(shù)臺(tái)邊取黃豆粒大小肝臟3～4塊，在2.5%的戊二醛中4℃固定2 h，用磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min，之后再用1%鋨酸固定2 h，雙蒸水沖洗并脫水后進(jìn)行包埋并切片，并在電鏡下觀察線粒體形態(tài)。

1.3.5 肝臟線粒體蛋白提取及western blotting檢測(cè)

取上述正常和高脂飲食組雄鼠各2只，脫頸處死后取0.2 g肝臟勻漿，依據(jù)線粒體提取試劑盒說(shuō)明粗提線粒體。線粒體蛋白經(jīng)BCA法定量后以40 μg上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后孵育一抗過(guò)夜。次日孵育二抗(1∶4000)后以ECL法使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集熒光信號(hào)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠肥胖表型

高脂飲食組小鼠喂養(yǎng)前四周體重持續(xù)高于正常飲食組小鼠；高脂喂養(yǎng)6周后，小鼠體重達(dá)到(37.17±1.23)g，而正常飲食組小鼠體重僅為(29.95±1.30)g，二者相比具有顯著性差異(P=0.0002，圖1A)，結(jié)果表明高脂飲食以后小鼠體重明顯增加。正常飲食組小鼠肝臟切片HE染色顯示肝細(xì)胞呈多邊形，界限清楚，胞漿豐富；高脂飲食組小鼠肝臟切片可見(jiàn)不同程度的肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪空泡(圖1B)。結(jié)果表明高脂模型建立成功。

注：A：與正常飲食小鼠比較，*P< 0.05，***P< 0.001；B:小鼠肝臟石蠟切片HE染色。圖1 高脂飲食對(duì)小鼠體重和肝臟脂肪的影響(n=6，Bar=50 μm)Note.A：Compared with the RD mice, *P< 0.05，***P< 0.001.B:RD mice and HF mice. HE staining.Fig.1 Effect of high fat feeding on the body weight and liver fat of the mice

2.2 高脂誘導(dǎo)和正常飲食小鼠肝臟差異基因的GO本體分析

利用第二代高通量基因測(cè)序技術(shù)，對(duì)高脂飲食組和正常飲食組小鼠的肝臟mRNA進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序，差異基因的P值限定為0.01后得到差異基因列表，共得到437個(gè)差異基因。利用DAVID工具對(duì)差異基因進(jìn)行GO本體分析，從細(xì)胞組成上對(duì)基因進(jìn)行注釋(表1)，發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與線粒體、線粒體基質(zhì)、線粒體內(nèi)膜和細(xì)胞器膜等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成。其中，線粒體組成相關(guān)基因數(shù)量最多，對(duì)其相關(guān)基因進(jìn)行功能分析(表2)，發(fā)現(xiàn)線粒體中基因功能大多跟氧化磷酸化相關(guān)。研究表明，線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化進(jìn)行的重要場(chǎng)所，作為細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化的核心細(xì)胞器，對(duì)于維持體內(nèi)能量平衡尤為重要。所以本研究認(rèn)為在高脂飲食的條件下，細(xì)胞組成的差異基因主要集中在線粒體中，且與氧化磷酸化相關(guān)。

2.3 高脂誘導(dǎo)和正常飲食小鼠肝臟差異基因的KEGG通路分析

對(duì)差異基因進(jìn)行KEEG通路分析(表3)，發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/葡萄糖生成、脂肪消化吸收以及不飽和脂肪酸生物合成等通路，這些通路基本都與線粒體的氧化磷酸化功能相關(guān)，與GO本體分析結(jié)果一致。

表1 高脂誘導(dǎo)和正常喂養(yǎng)小鼠肝臟差異基因的GO本體分析Tab.1 GO analysis of differentially expressed genes between the RD mice and HF mice

注：Fisher檢驗(yàn)，P< 0.1；Benjamini-Hochberg校正，P< 1。

Note.Fisher’s exact test，P< 0.1.Benjamini-Hochberg correction，P< 1.

表2 線粒體中差異基因功能分析Tab.2 Functional analysis of differential genes in the mouse mitochondria

表3 高脂誘導(dǎo)和正常喂養(yǎng)小鼠肝臟差異基因的KEGG通路分析Tab.3 The KEGG pathway of differentially expressed genes between the RD mice and HF mice

注：Fisher檢驗(yàn)，P< 0.1；Benjamini-Hochberg校正，P< 1。

Note.Fisher’s exact test，P< 0.1.Benjamini-Hochberg correction，P< 1.

2.4 高脂喂養(yǎng)引起小鼠肝臟線粒體形態(tài)變化

正常飲食組小鼠肝細(xì)胞線粒體呈橢圓形結(jié)構(gòu)，嵴形態(tài)正常，糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較為豐富(圖2A)。高脂飲食組小鼠肝臟線粒體嵴模糊、斷裂甚至消失。線粒體結(jié)構(gòu)不規(guī)則且有融合趨勢(shì)，表現(xiàn)為變形、增大甚至破裂壞死(圖2B)。

2.5 高脂誘導(dǎo)影響小鼠肝臟線粒體功能蛋白的表達(dá)

為進(jìn)一步驗(yàn)證高脂喂養(yǎng)對(duì)肝臟線粒體的影響，提取了肝臟的線粒體蛋白，利用western blotting技術(shù)檢測(cè)線粒體相關(guān)蛋白和FKBP51的表達(dá)。結(jié)果顯示，高脂飲食后，小鼠肝臟線粒體中融合蛋白MFN1和抗細(xì)胞增殖蛋白PHB1蛋白與內(nèi)參COXIV相比，表達(dá)量顯著升高，F(xiàn)KBP51蛋白表達(dá)量顯著降低(圖3)。這些結(jié)果表明高脂飲食可能通過(guò)MFN1和PHB1蛋白影響線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，F(xiàn)KBP51基因可能在這一過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

3 討論

本研究通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)小鼠6周，發(fā)現(xiàn)高脂飲食組和正常飲食組小鼠體重明顯高于對(duì)照組，且HE染色顯示高脂喂養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪堆積，表明高脂誘導(dǎo)小鼠肥胖模型建立成功。利用第二代高通量基因測(cè)序技術(shù)，對(duì)高脂喂養(yǎng)和正常飲食小鼠的肝臟mRNA進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序，以此來(lái)闡述高脂飲食對(duì)肝臟組織產(chǎn)生的影響，揭示其中的分子機(jī)制。共得到437個(gè)差異基因，利用DAVID工具對(duì)差異基因進(jìn)行GO本體分析，從細(xì)胞組成上對(duì)基因進(jìn)行注釋，可以看出差異基因主要涉及到線粒體、線粒體基質(zhì)、線粒體內(nèi)膜和細(xì)胞器膜等方面，對(duì)差異基因進(jìn)行KEEG通路分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/葡萄糖生成、脂肪消化吸收以及不飽和脂肪酸生物合成等通路，這些通路基本都與線粒體的氧化磷酸化功能相關(guān)。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)之一，是檸檬酸循環(huán)及氧化磷酸化進(jìn)行的重要場(chǎng)所，有細(xì)胞“能量工廠”之稱[4]。線粒體在體內(nèi)能量代謝的氧化磷酸化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這些過(guò)程影響了生物體內(nèi)幾種成分的生物合成，包括氨基酸生物合成，核苷酸生物合成以及血紅素生物合成等。因此，研究高脂喂養(yǎng)與正常飲食小鼠RNA-seq，對(duì)于從分子水平揭示高脂飲食在生物體內(nèi)的作用是一個(gè)重要突破口。

圖3 肝臟線粒體中FKBP51、MFN1和PHB1的表達(dá)Fig.3 Expression of FKBP51, MFN1 and PHB1 in the mitochondria of RD and HF mouse hepatocytes

電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，提示高脂飲食導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)改變。線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)主要受線粒體融合蛋白MFN1和MFN2等蛋白的調(diào)控，它們通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體融合及裂變的動(dòng)態(tài)平衡影響線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。其中，MFN1蛋白是線粒體膜融合的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)異?？蓪?dǎo)致線粒體膜結(jié)構(gòu)改變，使線粒體融合分裂功能受損。PHB1是一種分子伴侶蛋白，作為一種細(xì)胞表面受體，參與細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)錄以及線粒體蛋白質(zhì)折疊調(diào)節(jié)等，在維持線粒體正常結(jié)構(gòu)和功能方面起到重要作用[12]。通過(guò)western blotting技術(shù)分析線粒體功能相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MFN1和PHB1表達(dá)量顯著升高，提示高脂飲食導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變。進(jìn)一步通過(guò)western blotting技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)高脂飲食小鼠線粒體中共伴侶蛋白FKBP51表達(dá)量明顯低于對(duì)照組。

FKBP51是一種具有肽基脯氨酰順-反異構(gòu)酶活性的免疫親和蛋白，含有多肽重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(TPR)，能夠介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的相互作用，作為共伴侶蛋白參與GR等多種復(fù)合體的功能調(diào)節(jié)。Taishin等[13]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP51可以在線粒體中表達(dá)，是一個(gè)線粒體蛋白，起到保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的作用，當(dāng)其不在細(xì)胞核中時(shí)，F(xiàn)KBP51可與GR形成復(fù)合物定位于線粒體中，其在亞細(xì)胞中的定位是由細(xì)胞動(dòng)態(tài)條件改變的，當(dāng)FKBP51在線粒體中表達(dá)量減少，可能會(huì)通過(guò)影響線粒體的形態(tài)和功能從而調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪分化。

綜上所述，F(xiàn)KBP51通過(guò)影響線粒體形態(tài)與結(jié)構(gòu)來(lái)參與高脂誘導(dǎo)的線粒體損傷。

參考文獻(xiàn)：

[1] Savage DB, Petersen KF, Shulman GI. Disordered lipid metabolism and the pathogenesis of insulin resistance [J]. Physiol Rev, 2007, 87(2): 507-520.

[2] Wymann MP, Schneiter R. Lipid signalling in disease [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008, 9(2): 162-176.

[3] Lewis GF, Carpentier A, Adeli K, et al. Disordered fat storage and mobilization in the pathogenesis of insulin resistance and type 2 diabetes [J]. Endocr Rev, 2002, 23(2): 201-229.

[4] Fischer F, Hamann A, Osiewacz HD. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways [J]. Trends Biochem Sci, 2012, 37(7): 284-292.

[5] Fisher-Wellman KH, Neufer PD. Linking mitochondrial bioenergetics to insulin resistance via redox biology [J]. Trends Endocrinol Metab, 2012, 23(3): 142-153.

[6] Bach D, Pich S, Soriano FX, et al. Mitofusin-2 determines mitochondrial network architecture and mitochondrial metabolism. A novel regulatory mechanism altered in obesity [J]. J Biol Chem, 2003, 278(19): 17190-17197.

[7] Lagadari M, Zgajnar NR, Gallo LI, et al. Hsp90-binding immunophilin FKBP51 forms complexes with hTERT enhancing telomerase activity [J]. Mol Oncol, 2016, 10(7): 1086-1098.

[8] Yang L, Isoda F, Yen K, et al. Hypothalamic Fkbp51 is induced by fasting, and elevated hypothalamic expression promotes obese phenotypes [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2012, 302(8): E987-991.

[9] Stechschulte LA, Qiu B, Warrier M, et al. FKBP51 Null mice are resistant to diet-induced obesity and the PPARγ agonist rosiglitazone [J]. Endocrinology, 2016, 157(10): 3888-3900.

[10] Toneatto J, Charo NL, Susperreguy S, et al. [The dynamic mitochondria-nuclear redistribution of FKBP51 during the process of adipocyte differentiation is regulated by PKA] [J]. Medicina (B Aires), 2013, 73(5): 401-405.

[11] Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics [J]. Nat Rev Genet, 2009, 10(1): 57-63.

[12] Artal-Sanz M, Tsang WY, Willems EM, et al. The mitochondrial prohibitin complex is essential for embryonic viability and germline function in Caenorhabditis elegans [J]. J Biol Chem, 2003, 278(34): 32091-32099.

[13] Toneatto J, Guber S, Charo NL, et al. Dynamic mitochondrial-nuclear redistribution of the immunophilin FKBP51 is regulated by the PKA signaling pathway to control gene expression during adipocyte differentiation [J]. J Cell Sci, 2013, 126(Pt 23): 5357-5368.