李 坤， 張育民， 王亞康， 郭建斌

西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院關(guān)節(jié)外科髖關(guān)節(jié)病區(qū)，西安 710054

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一組由關(guān)節(jié)邊緣處的骨骼變化、關(guān)節(jié)軟骨完整性異常及關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨退化引起的異質(zhì)性癥候群，與多種炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子等致病因素密切相關(guān)，是老年人群普遍存在的慢性疾病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)也造成了巨大的負(fù)擔(dān)[1-2]。OA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，軟骨細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的異常增殖、遷移導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨愈合、修復(fù)能力異常可能是其主要的致病原因[3]，這也是目前最主要的治療靶標(biāo)。

微小RNA(microRNA/miRNA/miR)是長(zhǎng)度在21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，可通過對(duì)靶基因mRNA進(jìn)行切割或翻譯抑制，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等多個(gè)生物學(xué)過程[4]。研究[5-9]表明，一系列的miRNAs(miR-602、miR-608、miR-30、miR-146a、miR-183)可能參與了OA的發(fā)生發(fā)展，且與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)或血管細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá)相關(guān)。

MiR-543對(duì)MMP7有調(diào)控作用，可能參與調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞ECM的平衡[10]，與骨肉瘤腫瘤細(xì)胞的糖酵解和增殖亢進(jìn)有關(guān)[11]，但目前關(guān)于其在OA中的作用及機(jī)制尚不明確。因此，本研究基于大鼠OA模型及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討miR-543對(duì)大鼠OA模型軟骨細(xì)胞的可能作用及機(jī)制，為OA的臨床防治提供參考靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 DMEM-F12培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶、青-鏈霉素、胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；miR-543 mimics及相應(yīng)陰性對(duì)照、轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海吉瑪基因化學(xué)科技有限公司；MTT、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TRIzol試劑、RT-PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量試劑盒、鼠雙微體基因4(murine double minute 4, MDM4)、蛋白激酶B1(protein kinase B1, PKB1/Akt1)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 動(dòng)物分組及OA模型的建立 30只健康SD大鼠購(gòu)自濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(魯)20140006。大鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng)，隨機(jī)均分為OA模型組及正常對(duì)照組(n=15)，正常對(duì)照組大鼠不做特殊處理，OA模型組大鼠采用0.5%水合氯醛(0.35 g/100 g)腹腔注射麻醉后切斷膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，建立OA模型，術(shù)后每天對(duì)兩組大鼠肌內(nèi)注射青霉素2×104U/kg，共3 d。1周后，每天驅(qū)趕OA模型組及正常對(duì)照組大鼠跑步30 min。

1.3 軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)及miR-543 mimics的轉(zhuǎn)染 無菌條件下取正常大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨，切下組織一部分用于RNA抽提，另一部分置于含雙抗的磷酸鹽緩沖液清洗，300×g離心10 min，棄上清，20%胎牛血清DMEM-F12培養(yǎng)基37℃、適當(dāng)濕度、5%CO2培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞以2×105/cm2的密度接種于12孔板，待細(xì)胞融合達(dá)60%～80%時(shí)，按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染miR-543 mimics及相應(yīng)陰性對(duì)照(miR-543-NC)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期待測(cè)軟骨細(xì)胞，96孔板中每孔接種5 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立無細(xì)胞的空白對(duì)照。細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-543 mimics后，10 ng/L IL-1β處理24 h，每孔加入5 μg/mL MTT溶液20 μL，孵育4 h后棄上清，加入DMSO 200 μL/孔，振蕩10 min，酶標(biāo)儀讀取光密度(D490)值，重復(fù)3次。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及炎癥因子基因的表達(dá) 原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，不轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)染miR-543 mimics或miR-543-NC 48 h后，加入10 ng/L IL-1β連續(xù)培養(yǎng)24 h，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行real-time PCR檢測(cè)待測(cè)基因表達(dá)水平，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作，待測(cè)基因及內(nèi)參序列如表1。反應(yīng)條件：95℃，3 min；40個(gè)PCR循環(huán)(95℃，15 s；55℃，20 s；72℃，20 s；83.5℃，15 s)；95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s。以ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，收集熒光信號(hào)，繪制熔解曲線，以2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析相關(guān)基因的表達(dá)水平。

1.6 Western印跡法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，不轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)染miR-543 mimics或miR-543-NC 48 h后提取待測(cè)細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將各組蛋白與上樣緩沖液(loading buffer)充分混合后100℃變性5 min，每孔50 μL加入到十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠上樣孔，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。加入按使用說明稀釋后的待測(cè)一抗4℃過夜。TBST緩沖溶液清洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)。37℃孵育1 h，TBST緩沖液清洗后以ECL發(fā)光液顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH作為內(nèi)參分析MDM4、Akt1、Bcl-2等蛋白的表達(dá)水平。

MDM4:鼠雙微體基因4(murine double minute 4); Akt1:蛋白激酶B1(protein kinase B1, PKB1); Bcl-2:B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2); TNF-α:腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α); IL-6:白細(xì)胞介素-6(interleukin-6)

2 結(jié) 果

2.1 MiR-543在OA模型大鼠軟骨組織及IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中的表達(dá)變化 結(jié)果(圖1)表明：大鼠OA模型組軟骨組織miR-543表達(dá)較正常對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與未接受IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞相比，IL-1β誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞miR-543表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 OA模型大鼠軟骨組織及IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中miR-543的表達(dá)

2.2 軟骨細(xì)胞miR-543轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證 結(jié)果(圖2)表明：miR-543-NC轉(zhuǎn)染組軟骨細(xì)胞miR-543表達(dá)與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； miR-543-mimics轉(zhuǎn)染組軟骨細(xì)胞miR-543表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。

圖2 轉(zhuǎn)染后不同組別軟骨細(xì)胞miR-543的表達(dá)

2.3 上調(diào)miR-543表達(dá)對(duì)軟骨細(xì)胞增殖能力的影響 結(jié)果(圖3)表明：與正常對(duì)照軟骨細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-543 mimics后軟骨細(xì)胞增殖率明顯提升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與正常對(duì)照軟骨細(xì)胞相比，IL-1β誘導(dǎo)可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞增殖能力下降(P<0.05)，轉(zhuǎn)染miR-543 mimics上調(diào)miR-543表達(dá)后可逆轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用(P<0.05)。

2.4 上調(diào)miR-543表達(dá)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 結(jié)果(圖4)表明：與正常對(duì)照軟骨細(xì)胞相比，miR-543 mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞MDM4

mRNA表達(dá)下調(diào)，Akt1、Bcl-2 mRNA表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與正常對(duì)照軟骨細(xì)胞相比，IL-1β誘導(dǎo)后細(xì)胞MDM4 mRNA表達(dá)上調(diào)，Akt1、Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-543 mimics可減輕IL-1β誘導(dǎo)的MDM4、Akt1、Bcl-2 mRNA 表達(dá)變化(P<0.05)。

圖3 上調(diào)miR-543表達(dá)對(duì)軟骨細(xì)胞增殖能力的影響

圖4 上調(diào)miR-543表達(dá)對(duì)軟骨細(xì)胞MDM4、Akt1、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

2.5 上調(diào)miR-543表達(dá)對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響 結(jié)果(圖5)表明：與正常對(duì)照組相比，IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-543 mimics上調(diào)miR-543表達(dá)可減輕IL-1β誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)變化(P<0.05)。

圖5 上調(diào)miR-543表達(dá)對(duì)軟骨細(xì)胞炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.6 上調(diào)miR-543表達(dá)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果(圖6)表明：與正常對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-543 mimics軟骨細(xì)胞MDM4表達(dá)下降，Akt1、Bcl-2表達(dá)上升(P<0.05)；與正常對(duì)照組相比，IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞MDM4表達(dá)上升，Akt1、Bcl-2表達(dá)下降(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-543 mimics上調(diào)miR-543表達(dá)可減少IL-1β誘導(dǎo)的MDM4、Akt1、Bcl-2蛋白表達(dá)的變化。

圖6 上調(diào)miR-543表達(dá)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

1：對(duì)照組； 2： miR-543-mimics； 3： IL-1β； 4： miR-543-mimics+IL-1β

3 討 論

本研究結(jié)果表明miR-543在骨軟骨炎大鼠軟骨組織中表達(dá)明顯下降，提示miR-543正常表達(dá)可能對(duì)維持軟骨細(xì)胞的正常生理功能有重要意義。MiR-543功能獲得性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-543可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖(P<0.05)，減輕IL-1β誘導(dǎo)的增殖抑制作用(P<0.05)，提示miR-543表達(dá)抑制可能是OA的分子生物學(xué)病因之一，miR-543表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)對(duì)于OA的發(fā)生及病情評(píng)估有潛在的臨床價(jià)值。外源性miR-543補(bǔ)充對(duì)于緩解骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展具有積極意義。

軟骨細(xì)胞異常凋亡是骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的重要原因之一，MDM4可定位于凋亡的關(guān)鍵細(xì)胞器線粒體，激活TP53線粒體凋亡途徑，還可結(jié)合并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2功能，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，產(chǎn)生促凋亡作用[12]。Akt1則可調(diào)控mTOR信號(hào)通路，減少細(xì)胞凋亡[13]。MiR-543過表達(dá)的軟骨細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，MDM4表達(dá)降低，Bcl-2、Akt1表達(dá)升高。在IL-1β誘導(dǎo)下，miR-543表達(dá)可減少促凋亡蛋白MDM4的釋放，提高凋亡抵抗蛋白Bcl-2、Akt1的水平。在后續(xù)研究中，還需借助生物信息學(xué)分析及熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)miR-543對(duì)MDM4、Akt1、Bcl-2是否存在直接的調(diào)控作用。

OA發(fā)病過程中，炎癥因子的過表達(dá)與OA的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，大量炎癥因子釋放不僅會(huì)造成軟骨細(xì)胞損傷，還可影響軟骨細(xì)胞分化、誘導(dǎo)ECM降解[14-15]。IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)明顯上升(P<0.05)，提示IL-1β可造成軟骨細(xì)胞炎癥損傷，而miR-543過表達(dá)時(shí)，TNF-α、IL-6表達(dá)被抑制(P<0.05)，提示miR-543可能還有減輕炎癥損傷的作用。

綜上所述，OA大鼠軟骨組織與正常軟骨組織相比miR-543表達(dá)明顯下調(diào)。過表達(dá)miR-543可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，下調(diào)MDM4蛋白表達(dá)，上調(diào)Akt1、Bcl-2蛋白表達(dá)，導(dǎo)致炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)降低，可拮抗IL-1β誘導(dǎo)的增殖抑制、促凋亡蛋白上調(diào)、抗凋亡蛋白下調(diào)、促炎癥因子產(chǎn)生作用，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[ 1 ] DAMMAN W, LIU R, KROON F P, et al.Do comorbidities play a role in hand osteoarthritis disease burden? Data from the hand osteoarthritis in secondary care cohort[J].J Rheumatol,2017, 44(11):1659-1666.

[ 2 ] 陳 亮，楊曉凌.骨關(guān)節(jié)炎患者血清中炎性因子IL-1β、IL-6和COX-2的表達(dá)[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué),2016,23(1)：61-62.

[ 3 ] BADAWY M, FENSTAD A M, BARTZ-JOHANNESSEN C A, et al. Hospital volume and the risk of revision in Oxford unicompartmental knee arthroplasty in the Nordic countries -an observational study of 14,496 cases[J].BMC Musculoskelet Disord, 2017,18(1):388.

[ 4 ] SHAH R, YERI A S, DAS A, et al. Small RNA-seq during acute maximal exercise reveal RNAs involved in vascular inflammation and cardiometabolic health: brief report[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2017,313(6):H1162-H1167.

[ 5 ] BEYER C, ZAMPETAKI A, LIN N Y, et al.Signature of circulating microRNAs in osteoarthritis[J]. Ann Rheum Dis, 2015,74(3):e18.

[ 6 ] AKHTAR N, MAKKI M S, HAQQI T M.MicroRNA-602 and microRNA-608 regulate sonic hedgehog expression via target sites in the coding region in human chondrocytes[J].Arthritis Rheumatol, 2015,67(2):423-434.

[ 7 ] LI L, YANG C, LIU X, et al. Elevated expression of microRNA-30b in osteoarthritis and its role in ERG regulation of chondrocyte[J]. Biomed Pharmacother, 2015,76:94-99.

[ 8 ] YAMASAKI K, NAKASA T, MIYAKI S, et al. Expression of MicroRNA-146a in osteoarthritis cartilage[J]. Arthritis Rheum, 2009,60(4):1035-1041.

[ 9 ] LI X, KROIN J S, KC R, et al. Altered spinal microRNA-146a and the microRNA-183 cluster contribute to osteoarthritic pain in knee joints[J]. J Bone Miner Res, 2013,28(12):2512-2522.

[10] SONG N, LIU H, MA X, et al. Placental growth factor promotes metastases of ovarian cancer through MiR-543-regulated MMP7[J]. Cell Physiol Biochem, 2015,37(3):1104-1112.

[11] ZHANG M, LYGRISSE K, WANG J. Role of microRNA in osteoarthritis[J]. J Arthritis, 2017,6(2).pii:239.

[12] MANCINI F, PIERONI L, MONTELEONE V, et al. MDM4/HIPK2/p53 cytoplasmic assembly uncovers coordinated repression of molecules with anti-apoptotic activity during early DNA damage response[J].Oncogene, 2016,35(2):228-240.

[13] TANG H, CHEN J, FRAIDENBURG D R, et al. Deficiency of Akt1, but not Akt2, attenuates the development of pulmonary hypertension[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2015,308(2): L208-L220.

[14] DA SILVA M R, LINHARES D, VASCONCELOS D M, et al.Neuroimmune expression in hip osteoarthritis: a systematic review[J].BMC Musculoskelet Disord, 2017,18(1):394.

[15] MA C H, WU C H, JOU I M, et al. PKR activation causes inflammation and MMP-13 secretion in human degenerated articular chondrocytes[J].Redox Biol, 2018,14:72-81.