胡慧慧 羅達 秦智亮 馬瑞松 余小梅 何勃 魯志兵 李元紅 江洪

自主神經(jīng)失衡是心力衰竭(簡稱心衰)的重要特征之一，與心衰的發(fā)生、發(fā)展密切相關[1-3]。通過迷走神經(jīng)刺激(VNS)提高副交感神經(jīng)活性已被證明有助于調(diào)控自主神經(jīng)平衡和改善心衰預后。既往大量的實驗研究表明，VNS可抑制心衰中左室進行性擴大和改善左室收縮功能[4-5]。臨床研究也證實了VNS在心衰患者中的有效性和安全性[6-8]。心房神經(jīng)節(jié)叢(GP)是心臟副交感節(jié)后神經(jīng)元聚集的部位，不僅可以作為迷走神經(jīng)和心臟之間的中繼站，而且可作為心臟內(nèi)在和外在自主神經(jīng)系統(tǒng)的“整合中心”[9]。筆者探討低強度GP刺激對急性心肌梗死(AMI)后心衰犬心臟功能及自主神經(jīng)重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1動物準備 本研究所用動物由武漢大學動物實驗倫理委員會審核并批準。體重18～20 kg的健康成年雜種犬18只，由武漢大學人民醫(yī)院實驗動物中心提供。實驗動物按4∶5比例隨機分為對照組(n=8)和GP刺激組(GPS組，n=10)。所有犬以苯巴比妥鈉30 mg/kg靜脈麻醉，實驗過程中每小時補充2 mg/kg以維持麻醉狀態(tài)。氣管插管接動物呼吸機(ALC．V10，上海奧爾科特生物科技有限公司)，給予持續(xù)正壓通氣。分離一側(cè)股動脈，連接壓力感受器監(jiān)測動脈血壓，分離一側(cè)股靜脈，置入鞘管，實驗過程中用于靜脈滴注生理鹽水補液。持續(xù)記錄體表標準肢體導聯(lián)心電圖。所有電生理信號和血壓信號在多導電生理儀系統(tǒng)(Lead．7000成都錦江電子公司)上記錄和分析。

1.2心肌梗死后心衰模型建立 所有犬經(jīng)左側(cè)第4肋間隙開胸暴露位于左心耳和左肺動脈之間、左上肺靜脈與左房交界處的左上GP及冠狀動脈前降支。結(jié)扎左冠狀動脈前降支近端(發(fā)出第一對角支前)制造AMI模型[10]。左室體積增大伴左室射血分數(shù)(LVEF)<0.40定義為心衰。將自制的雙極電極縫于左室游離壁，電極連接刺激器(Lead 7000，錦江公司，成都，中國)用于心室起搏(圖1)。心室起搏參數(shù)為：頻率180～220次/分，脈寬1.5 ms，電壓為2倍起搏閾值。AMI 1 h后開始心室起搏(VP)，持續(xù)6 h。

PA=肺動脈；LAD=冠狀動脈左前降支；D=對角支動脈；LSPV=左上肺靜脈；LIPV=左下肺靜脈；LAA=左心耳；LV=左室；LSGP：左上神經(jīng)節(jié)叢；LOM=Marshall韌帶；Ligation Site=結(jié)扎位點；Pacing Site=起搏位點

圖1心臟電極位置示意圖

1.3低強度GP刺激 另一個自制的雙極電極植入位于左上肺靜脈與心房交界處相鄰含有左上GP的脂肪墊中，電極尾端連于電刺激儀(Grass-S88，Grass Instruments，Quincy，MA)(圖1)。GPS組AMI 1 h后進行GP刺激。GP刺激的參數(shù)[11]為：頻率20 Hz；脈寬2 ms；刺激強度，引起竇性心率下降10%的電壓強度(1.0～10 V)。低強度GP刺激持續(xù)6 h，每2 h對刺激電壓進行校正以使其維持降低心率10%。對照組不給于刺激。

1.4心臟超聲檢查 在犬左、右側(cè)臥位時，分別使用M4S-RS探頭(頻率1.5 ～3.6 MHz)獲得經(jīng)胸二維超聲心動圖。記錄標準的短長軸胸骨旁切面和心尖二腔四腔切面的圖像并測量左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)、收縮末期室間隔厚度(IVSS)和LVEF。GPS組分別在基礎狀態(tài)、AMI-1 h、VP-3 h、VP-6 h進行心臟超聲檢測。對照組于相應時間點檢測。測量前閉合手術切口并抽取胸膜腔內(nèi)空氣。所有參數(shù)均在三個心動周期內(nèi)測定并取平均值。

1.5血清指標測定 GPS組于基礎狀態(tài)、AMI-1 h、VP-2 h、VP-4 h、VP-6 h，對照組于相應時間點分別采所有犬頸靜脈血注入肝素鈉抗凝管搖勻，靜置 10 min后以3 000 r/min 離心15 min，分離血清，-80℃冰箱保存。采用犬酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(美國Sigma公司)，按照試劑盒說明書規(guī)范操作檢測血漿去甲腎上腺素(NE)、腦鈉肽(BNP)、血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)。

1.6梗死周邊區(qū)及左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)(LSG)相關蛋白測定 在實驗結(jié)束時，取左室梗死周邊區(qū)新鮮心肌組織和LSG并存放在-80℃冰箱保存。采用Western Blot法檢測心肌梗死周邊區(qū)生長相關蛋白 43(GAP-43)、酪氨酸羥化酶(TH)以及LSG中c-fos、神經(jīng)生長因子(NGF)的表達。冰凍組織制成勻漿液，取適量組織裂解液提取相應組織總蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳，之后轉(zhuǎn)至PVDF膜。含有抗GAPDH、GAP-43、TH、β-actin、c-fos、NGF抗體封閉液浸泡 PVDF膜， 4℃ 孵育過夜。各蛋白相應的二抗體室溫孵育1 h。各蛋白質(zhì)的特異性抗體的濃度均從供應商的說明書中獲得。ECL顯現(xiàn)條帶。分別用GAPDH、β-actin標準化待測蛋白的表達。

2 結(jié)果

實驗過程中，對照組有2只犬死于心室顫動，GPS組有1只死于心衰。所有犬制作心肌梗死后心衰模型成功。最后入組例數(shù)分別為對照組6只，GPS組9只。

2.1兩組心臟超聲指標比較 與基礎狀態(tài)相比，兩組AMI-1 h、VP-3 h、VP-6 h的LVEDV、LVESV均有增加趨勢，LVEF和IVSS均有減少趨勢，但組內(nèi)各時間點的LVEDV、LVESV、LVEF無差異(P均>0.05)。然而，GPS組VP-3 h、VP-6 h的IVSS明顯高于對照組(P均<0.05)。另VP 6 h后，與對照組相比，GPS組LVEF有改善的趨勢，但無差異(P=0.074)。見表1。

表1 低強度GP刺激對左室功能的影響

注：與對照組相應時間比較，*P<0．05

2.2兩組血漿BNP、NE和AngⅡ水平的比較 與基礎狀態(tài)相比，兩組AMI 1 h后血漿BNP、NE、AngⅡ均顯著升高(P<0.05)。與對照組相比， GPS組VP-6 h顯著抑制BNP、NE、AngⅡ水平的升高(P均<0.05)，而GPS組血漿BNP、NE、AngⅡ在VP-2 h和VP-4 h無差異(P均>0.05)。見表2。

2.3兩組左室梗死周圍心肌組織中GAP43和TH蛋白表達 與對照組比較，GPS組心肌組織中GAP43和TH顯著降低(P均<0.05)。見圖2、表3。

2.4兩組LSG中c-fos、NGF的蛋白表達 與對照組相比，GPS組c-fos和NGF的蛋白水平均顯著降低(P均<0.05)。見圖2、表3。

圖2兩組左室梗死周圍心肌細胞中GAP43、TH及LSG中c-fos、NGF蛋白表達

3 討論

本研究探討了GPS對AMI后心衰犬心功能和自主神經(jīng)的影響。結(jié)果表明，GPS可能有利于改善心臟功能，這可能與其抑制神經(jīng)重塑和心臟神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)有關。本研究采用AMI后快速心室起搏誘發(fā)心衰來模擬心衰逐漸惡化的進程，所有實驗犬經(jīng)過6 h起搏后LVEF均下降。

雖然兩組之間的LVEF、LVEDV、LVESV無顯著性差異，但在VP-6 h后顯示GPS組LVEF有改善的趨勢。 然而，GPS組在VP-3 h和VP-6 h的IVSS顯著高于對照組，說明GPS可以改善室間隔室壁運動。這一結(jié)果提示，GPS可以緩解冠狀動脈結(jié)扎造成的室間隔心肌梗死面積的快速擴張。6 h GPS對室間隔厚度的改善作用表明GPS對心臟重構(gòu)有保護作用，進而可能會影響心臟功能。血漿BNP水平與左室心肌細胞重構(gòu)[12]密切相關，可反映心衰嚴重程度。因而，血漿BNP水平的降低提示左室收縮功能的改善。在筆者的研究中，6 h GPS抑制了血漿BNP水平的增加，表明GPS可能有助于抑制急性心衰的進展。

表2 兩組血漿BNP、NE和AngⅡ的水平變化

注：與同組基礎狀態(tài)比較，*P<0.05；與對照組相應時間點比較，#P<0.05

表3 兩組左室梗死周圍心肌組織中GAP43、TH及LSG中c-fos、NGF蛋白表達

交感神經(jīng)的過度激活和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的活化是心衰的病理生理的兩個重要因素。心臟交感神經(jīng)高度活化和心衰患者的血漿NE水平增加與左室功能不全的嚴重程度相關[13]。在筆者的研究中，6 h GPS顯著減弱心肌梗死后快速心室起搏誘發(fā)的NE、AngⅡ水平的增加，說明GPS可以抑制交感神經(jīng)活性和RASS。

心肌梗死后心肌組織以及LSG會出現(xiàn)神經(jīng)重構(gòu)。GAP43在神經(jīng)發(fā)育、軸突再生及結(jié)構(gòu)的可塑性中有至關重要的作用，TH可作為交感神經(jīng)的標志物[14]。c-fos往往在神經(jīng)元放電時表達，也被作為神經(jīng)元廣泛活化的標記[15]。NGF是促進神經(jīng)生長的重要因子。Zhou等[16]研究表明AMI可在3.5 h內(nèi)誘導局部NGF濃度立即升高，同時GAP43也在梗死區(qū)表達上調(diào)。此外，NGF和GAP43可逆行轉(zhuǎn)運至LSG，從而引發(fā)非梗死區(qū)的神經(jīng)生長。本研究中，6 h GPS抑制左室梗死周圍區(qū)GAP43和TH的表達，同時也可抑制c-fos和NGF蛋白在LSG的表達，表明GPS可以改善心肌梗死后心肌組織和LSG 中的交感神經(jīng)重構(gòu)。而交感神經(jīng)重構(gòu)與室性心律失常、心臟猝死密切相關。 GPS抑制AMI后交感神經(jīng)重構(gòu)，提示其對心肌梗死后室性心律失常和心源性猝死的發(fā)生可能有一定的保護作用。

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