袁申戌 黃兵 余鋰鐳 王夢(mèng)龍 周麗平 江洪

近年來(lái)，有研究表明白細(xì)胞介素17A(IL-17A)與多種心血管疾病相關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死等[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)IL-17A干預(yù)顯著惡化心肌梗死后缺血再灌注損傷以及遠(yuǎn)期的心室重構(gòu)[2-4]。既往研究表明IL-17A可以誘導(dǎo)炎癥，而炎癥可以激活交感神經(jīng)[5-6]。同時(shí)右側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)(RSG)的激活是不適當(dāng)竇性心動(dòng)過(guò)速(IST)的重要環(huán)節(jié)[7]。所以筆者推測(cè)IL-17A可能可通過(guò)激活RSG在IST發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。筆者通過(guò)測(cè)定RSG功能、神經(jīng)活性、早期原癌基因(c-fos)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)表達(dá)水平來(lái)評(píng)估IL-17A對(duì)于RSG的功能和活性的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及準(zhǔn)備 本研究由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，研究嚴(yán)格遵守由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院出版的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保健和使用指南( NIH出版No.85-23，修訂于1996)。體重18～20 kg的健康成年雜種犬16只(由武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組 (n=8)和對(duì)照組 (n=8)。經(jīng)3%戊巴比妥鈉30 mg /kg靜脈麻醉，每小時(shí)補(bǔ)充2 mg /kg 苯巴比妥鈉以維持麻醉狀態(tài)，氣管插管接動(dòng)物呼吸機(jī)(型號(hào)MAO01746，哈佛儀器，霍里斯頓，美國(guó))給予持續(xù)正壓通氣。在犬的下方放置一加熱墊以保持其體溫在36.5℃±1.5℃。分別穿刺左側(cè)股動(dòng)脈、股靜脈并置入鞘管，股動(dòng)脈通道用于監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓，股靜脈通道用于持續(xù)生理鹽水補(bǔ)液。將電極片固定于犬四肢表皮，以Ⅱ?qū)?lián)作為監(jiān)護(hù)導(dǎo)聯(lián)，連接LEAD7000多導(dǎo)電生理儀(錦江電子，成都，四川)持續(xù)檢測(cè)體表心電圖和動(dòng)脈血壓。

1.2RSG內(nèi)給藥 右側(cè)第3肋間打開(kāi)胸腔，暴露RSG所在區(qū)域，用電極導(dǎo)管高頻電刺激(HFS：頻率20 Hz，脈寬0.1 ms)時(shí)能引起心率上升最高的位點(diǎn)即為RSG。IL-17A試劑購(gòu)自Sigma公司，利用生理鹽水將其配置成100 μg/ml置于-20℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水將其稀釋至25 μg/ml。實(shí)驗(yàn)組將1 ml IL-17A在直視狀態(tài)下均勻分4個(gè)注射點(diǎn)緩慢注射到RSG內(nèi)，使IL-17A充分進(jìn)入RSG。對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。

1.3RSG功能測(cè)定 根據(jù)我們既往研究[7]，將一根直徑0.1 mm 的銀絲插入RSG，連接刺激儀，以20 V的高頻刺激(HFS：頻率20 Hz，脈寬0.1 ms)尋找到刺激RSG時(shí)心率變化最大的位點(diǎn)，在該位點(diǎn)處固定銀金屬絲。分別在基礎(chǔ)狀態(tài)以及藥品注射后30 min以10、20、30、40、50V的高頻電刺激RSG測(cè)定HFS引起的最大心率變化百分比，以最大心率變化百分比代表RSG功能。

1.4RSG神經(jīng)活性測(cè)定 參照?qǐng)F(tuán)隊(duì)既往研究[8]，將兩個(gè)鎢絲微電極用微型固定器并列固定，調(diào)整微電極尖端距離2～3 mm，微電極尖端插入RSG記錄神經(jīng)活性。電極連接PowerLab神經(jīng)活性記錄儀(AD Instruments, 澳大利亞)，采樣頻率設(shè)置為300～1 000 Hz，通過(guò)一個(gè)放大器(DP-304, 華納儀器, 美國(guó))進(jìn)行放大。神經(jīng)活性信號(hào)定義為高于噪音振幅3倍的記錄信號(hào)，尋找信噪比穩(wěn)定且大于3倍的位點(diǎn)，固定微電極并長(zhǎng)時(shí)間記錄神經(jīng)信號(hào)。分別在基礎(chǔ)狀態(tài)和藥品注射后30 min記錄RSG神經(jīng)活性，采用Labchart分析軟件分析神經(jīng)活性頻率和振幅。

1.5RSG中c-fos和NGF測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在直視下留取RSG組織，用0.9%生理鹽水沖洗后迅速置于-80℃冰箱中備用。取適量RSG組織以二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，取50 μg蛋白上樣，采用10%SDS-PAGE膠電泳，目的蛋白充分分離后200 mA×50 min半干轉(zhuǎn)至PVDF膜。含5%脫脂奶粉的TBST封閉液浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉1 h，封閉后用TBST洗膜5 min，共3次。將PVDF膜置于一抗(NGF、c-fos：Abcam，劍橋，英國(guó))中4°C孵育過(guò)夜。添加相應(yīng)種屬的二抗室溫孵育1 h，TBST洗沖分洗滌PVDF膜，用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)目的條帶，以GAPDH為內(nèi)參分析c-ofs和NGF表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件( SPSS Inc．芝加哥，美國(guó)) 進(jìn)行。組間比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1兩組RSG功能的比較 實(shí)驗(yàn)組干預(yù)30 min后心率加快(P<0.05)，而對(duì)照組心率無(wú)明顯升高(P>0.05)。與對(duì)照組干預(yù)30 min后比較，實(shí)驗(yàn)組心率加快作用顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組不同刺激電壓下基礎(chǔ)狀態(tài)和干預(yù)30 min后的最大心率變化百分比

注：與同組基礎(chǔ)狀態(tài)比較，*P<0.05；與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間比較，#P<0.05

2.2兩組RSG神經(jīng)活性的比較 實(shí)驗(yàn)組干預(yù)后RSG神經(jīng)活性頻率和幅度顯著升高(P<0.05)；而對(duì)照組中無(wú)明顯改變(P>0.05)。且干預(yù)30min后，對(duì)照組RSG神經(jīng)活性放電頻率和振幅顯著低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

2.3兩組RSG中c-fos和NRG的比較 兩組干預(yù)前后具有代表性的RSG中c-fos和NGF電泳圖見(jiàn)圖2。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組干預(yù)后RSG中c-fos和NGF的表達(dá)水平顯著升高(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

圖1 RSG神經(jīng)活性變化

組別放電頻率/(次/分)放電振幅/mV對(duì)照組 基礎(chǔ)狀態(tài)50±80．04±0．01(n=8) 30min后58±100．05±0．01實(shí)驗(yàn)組 基礎(chǔ)狀態(tài)48±100．04±0．01(n=8) 30min后148±22?#0．09±0．01?#

注：與同組基礎(chǔ)狀態(tài)比較，*P<0.05；與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間比較，#P<0.05

圖2 兩組干預(yù)后RSG中c-fos和NGF電泳圖

組別nc?fos相對(duì)蛋白水平NGF相對(duì)蛋白水平對(duì)照組80．55±0．090．11±0．03實(shí)驗(yàn)組80．58±0．08#0．16±0．04#

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05

3 討論

本研究主要發(fā)現(xiàn)向RSG中注射IL-17A可顯著增強(qiáng)RSG功能和活性，增加神經(jīng)相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

星狀神經(jīng)節(jié)由脊髓發(fā)出的頸下神經(jīng)節(jié)與第一胸交感神經(jīng)融合而成，是交感神經(jīng)系統(tǒng)支配心臟的重要節(jié)點(diǎn)，其心下神經(jīng)支加入心叢，調(diào)節(jié)心臟活動(dòng)。研究表明，左、右星狀神經(jīng)節(jié)對(duì)于心臟的調(diào)控具有偏側(cè)性，其中RSG主要調(diào)控竇房結(jié)的電活動(dòng)，刺激RSG可以引起竇性心率加快，阻滯RSG則可以減慢心率，延長(zhǎng)RR間期，對(duì)血壓幾乎沒(méi)有影響[9-11]。本研究結(jié)果中，HFS刺激RSG可顯著提升心率，同時(shí)IL-17A可顯著提高HFS刺激RSG所導(dǎo)致的最大心率變化百分比，增強(qiáng)RSG的功能。

IL-17A是IL-17家族成員中被報(bào)道最多的一個(gè)細(xì)胞因子。IL-17A參與到固有免疫與特異性免疫之中，誘導(dǎo)炎癥因子以及趨化因子的表達(dá)，從而招募更多的免疫細(xì)胞到達(dá)炎癥部位加劇機(jī)體的炎癥反應(yīng)[5, 12]。之前大量研究表明炎癥可以調(diào)控交感神經(jīng)活性。向大鼠穹隆下器官注射促炎因子TNF-α可以顯著提高腰椎和內(nèi)臟交感神經(jīng)活性并提升平均動(dòng)脈壓[13]。筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)直接向左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)注射IL-1β可以直接激活左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)，并增加心肌梗死后室性心律失常的發(fā)生[6]。反之，利用非特異性的細(xì)胞因子合成抑制劑或者特異性的TNF-α抑制劑阻斷炎癥通路均可抑制交感神經(jīng)活性[14]。同時(shí)，炎癥反應(yīng)中大量聚集的炎癥細(xì)胞如成肌纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以分泌NGF[15]。NGF是交感神經(jīng)生長(zhǎng)、分化的生物學(xué)標(biāo)志，被認(rèn)為是啟動(dòng)交感神經(jīng)病態(tài)生長(zhǎng)的神經(jīng)生長(zhǎng)因子[16]。c-fos蛋白在神經(jīng)元活動(dòng)時(shí)表達(dá)活躍，被廣泛用于神經(jīng)快速激活的標(biāo)志物[17]。這些研究表明炎癥反應(yīng)可以增加交感神經(jīng)活性。本研究在體神經(jīng)活性記錄提示IL-17A增強(qiáng)RSG神經(jīng)活性；同時(shí)增加c-fos和NGF表達(dá)，證實(shí)IL-17A可激活RSG。

筆者及其他學(xué)者的研究均證實(shí)抑制RSG活性可以顯著降低IST的發(fā)生[7,18]。IL-17A可能對(duì)于IST發(fā)生起到促進(jìn)作用，因此通過(guò)靶向IL-17A的治療可能成為治療藥物難治性IST的新策略。

1 Robert M, Miossec P. Effects of Interleukin 17 on the cardiovascular system [J]. Autoimmunity Reviews, 2017, 16(9): 984

2 Zhou S, Yuan J, Liao M, et al. IL-17A promotes ventricular remodeling after myocardial infarction [J]. Journal of Molecular Medicine, 2014, 92(10): 1 105

3 Yan X, Shichita T, Katsumata Y, et al. Deleterious effect of the IL-23/IL-17A axis and gammadelta T cells on left ventricular remodeling after myocardial infarction [J]. Journal of the American Heart Association, 2012, 1(5): e 004 408

4 Barry SP, Ounzain S, Mccormick J, et al. Enhanced IL-17 signalling following myocardial ischaemia/reperfusion injury [J]. International Journal of Cardiology, 2013, 163(3): 326

5 Chen K, Kolls JK. Interluekin-17A (IL17A) [J]. Gene, 2017, 614: 8

6 Wang M, Li S, Zhou X, et al. Increased inflammation promotes ventricular arrhythmia through aggravating left stellate ganglion remodeling in a canine ischemia model [J]. International Journal of Cardiology, 2017, 248: 286

7 Zhou X, Zhou L, Wang S, et al. The use of noninvasive vagal nerve stimulation to inhibit sympathetically induced sinus node acceleration: a potential therapeutic approach for inappropriate sinus tachycardia [J]. Journal of Cardiovascular Electrophysiology, 2016, 27(2): 217

8 黃兵，王夢(mèng)龍，余鋰鐳，等. 阻斷神經(jīng)元型Nav1.8通道對(duì)心臟交感神經(jīng)節(jié)活性和心室電生理性質(zhì)的影響[J]. 中國(guó)心臟起搏與心電生理雜志，2017，31(6)：587

9 Kashima T, Tanaka H, Minagoe S, et al. Electrocardiographic changes induced by the stellate ganglion block in normal subjects [J]. Journal of Electrocardiology, 1981, 14(2): 169

10 Fujiki A, Masuda A, Inoue H. Effects of unilateral stellate ganglion block on the spectral characteristics of heart rate variability [J]. Japanese Circulation Journal, 1999, 63(11): 854

11 Wu G, Desimone CV, Suddendorf SH, et al. Effects of stepwise denervation of the stellate ganglion: Novel insights from an acute canine study [J]. Heart Rhythm, 2016, 13(7): 1 395

12 Beringer A, Noack M, Miossec P. IL-17 in chronic inflammation: from discovery to targeting [J]. Trends in Molecular Medicine, 2016, 22(3): 230

13 Wei S, Yu Y, Zhang Z, et al. Proinflammatory cytokines upregulate sympathoexcitatory mechanisms in the subfornical organ of the rat [J]. Hypertension, 2015, 65(5): 1 126

14 Kang Y, He R, Yang L, et al. Brain tumour necrosis factor-alpha modulates neurotransmitters in hypothalamic paraventricular nucleus in heart failure [J]. Cardiovascular Research, 2009, 83(4): 737

15 Hasan W, Jama A, Donohue T, et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats [J]. Brain Research, 2006, 1124(1): 142

16 Chang C, Wu T, Zhou S, et al. Nerve sprouting and sympathetic hyperinnervation in a canine model of atrial fibrillation produced by prolonged right atrial pacing [J]. Circulation, 2001, 103(1): 22

17 Dragunow M, Robertson HA. Kindling stimulation induces c-fos protein(s) in granule cells of the rat dentate gyrus [J]. Nature, 1987, 329(6138): 441

18 Huang HD, Tamarisa R, Mathur N, et al. Stellate ganglion block: a therapeutic alternative for patients with medically refractory inappropriate sinus tachycardia[J]? Journal of Electrocardiology, 2013, 46(6): 693