熊思佳

王發(fā)祥1,2

俞 健1,2

李向紅1,2

王建輝1,2

郭星辛1,2

劉永樂1,2

(1.長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114；2.湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410114)

冷凍面團技術(shù)是20世紀50年代末發(fā)展起來的面包生產(chǎn)新工藝，利用冷凍原理將面團凍結(jié)和冷藏，需要時再解凍、醒發(fā)和烘烤，可避免傳統(tǒng)面包在保藏、運輸、銷售等環(huán)節(jié)的老化和品質(zhì)劣變，確保消費者吃上新鮮面包[1]。目前，冷凍面團技術(shù)已在許多國家和地區(qū)相當普及，中國雖然起步較晚，但仍具有廣闊的發(fā)展前景。然而，在冷凍面團實際生產(chǎn)中，酵母菌的耐冷凍性能一直是影響面團品質(zhì)的技術(shù)難題[2]。目前，國內(nèi)外不少學者已在耐凍酵母的選育上開展了大量工作[3-4]，但其應用效果有限且安全性存在較大爭議，因此酵母抗凍劑的優(yōu)選和開發(fā)仍然是改善冷凍面團品質(zhì)的最有效途徑。冰結(jié)構(gòu)蛋白是目前研究最多的一類酵母抗凍保護劑，但含量少且價格高，限制了其在冷凍面團中的應用[5]；其它抗凍劑如甘油[6]、海藻糖[7]、γ-聚谷氨酸鈉[8]也具有一定的酵母抗凍保護效果,但與冰結(jié)構(gòu)蛋白相比，這些傳統(tǒng)保護劑既沒有抗氧化、降血壓等功效，也不能改善冷凍面團的風味。

鰱魚(silver carp，Hypophthalmichthysmolitrix)又名白鰱、鰱子，屬鯉形目鯉科，因其生長速度快、疾病少、容易養(yǎng)殖，2016年養(yǎng)殖產(chǎn)量達4.506 6×106t，僅次于草魚，占中國淡水魚產(chǎn)量的16.01%。但鰱魚肉質(zhì)發(fā)面、肌間刺多、土腥味重，不僅食用品質(zhì)差，而且價格低廉，是最典型的大宗低值淡水魚，急需開發(fā)其高值化利用途徑。研究發(fā)現(xiàn)，鰱魚酶解產(chǎn)物具有較好的抗凍保護效果[9]，同時兼具良好的抗氧化性能[10-11]，若能將其應用于冷凍面團中酵母菌抗凍，不僅來源豐富、成本低廉，其豐富的游離氨基酸、短肽等還能增加面包的營養(yǎng)價值。目前，已有學者對鰱魚酶解產(chǎn)物的抗凍保護性能進行研究[12]，但沒有將鰱魚酶解產(chǎn)物作為酵母菌抗凍保護劑的相關(guān)報道，本試驗在前期研究基礎(chǔ)上，利用復合蛋白酶制備鰱魚酶解產(chǎn)物，分析其對面包酵母凍融循環(huán)過程中存活率的影響，旨在為應用鰱魚酶解產(chǎn)物提高冷凍面團中酵母菌的耐凍性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮鰱魚：購自湖南省長沙縣當?shù)剞r(nóng)民手中；

面包酵母：實驗室分離保藏；

麥芽汁培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

彩虹預染超低分子量蛋白Marker：1.2～45.0 kD，中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；

復合蛋白酶(來源于芽孢桿菌屬，酶活力≥1.5 AU/g)、N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)：上海笛柏化學品技術(shù)有限公司；

其它試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑；

電子天平：BL-920S型，日本島津；

自動發(fā)酵罐：BIOTECH-5M-7000A型，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；

恒溫水浴鍋：DK-98-ⅡA型，天津市泰斯特儀器有限公司；

高速離心機：LG10-24A型，北京金立離心機有限公司；

低溫高速冷凍離心機：Centrifuge 5430 R型，艾本德中國有限公司；

2) 移動基站。通過獲取手機連接的基站信息在運營商的庫中轉(zhuǎn)換成對應的經(jīng)緯度，將經(jīng)緯度對應到地圖上?；径ㄎ坏膬?yōu)點是只要有手機信號就能定位，在室內(nèi)和室外均可，無成本；缺點是定位誤差大，無法在室內(nèi)進行精準定位。

pH計：DELTA 320型，梅多勒-托利多(上海)有限公司；

雙垂直蛋白電泳儀：DYCZ-24 型，北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 酶解產(chǎn)物的制備 新鮮鰱魚宰殺取肉，多功能粉碎機搗碎，按固液比1∶5 (g/mL)的比例分散于水溶液中，加入自動發(fā)酵罐，升溫至50 ℃，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5，按魚肉干重的3%加入復合蛋白酶，攪拌水解，水解過程中自動滴加1 mol/L NaOH，使pH在6.5±0.05內(nèi)波動，分別于15，30，60，120，240 min后取樣，90 ℃滅酶15 min，4 000×g離心收集上清液后，冷凍干燥，得到系列不同水解度的鰱魚酶解產(chǎn)物[13]。

1.2.2 Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE) 電泳緩沖液、樣本緩沖液、AB-3(49.5% T，3% C)和AB-6(49.5% T，6% C)凝膠儲存液的配制及電泳過程均參考Sch?gger H[14]的方法。按表1中的配方分別制備分離膠、積層膠和濃縮膠，待凝固后加入電極緩沖液，點樣10 μL，內(nèi)槽加入陰極電極緩沖液，外槽加入陽極緩沖液，開始電泳，初始電壓30 V，直到樣品完全進入積層膠之后加壓至100 V，到達底部之前停止；后固定并硝酸銀染色，再進行拍照。

1.2.3 酵母菌培養(yǎng)液的制備 從斜面上取一環(huán)面包酵母接種至50 mL麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)24 h，為一級種子液；再取5 mL重新接種至50 mL麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)12 h，即為酵母菌培養(yǎng)液[15]，備用。

1.2.4 酵母菌抗凍性能的分析 取4支裝有9 mL無菌水的離心管，無菌條件下分別加入1 mL酵母菌培養(yǎng)液，震蕩混勻制得10-1稀釋度的菌懸液，取1支以涂布法進行平板稀釋計數(shù)(PDA培養(yǎng)基固體平板)，計算初始活菌數(shù)N0；其余3支置于-20 ℃冰箱冷凍保藏，每間隔1個凍融循環(huán)(-20 ℃冷凍16 h，4 ℃解凍8 h)取出1支進行平板稀釋計數(shù)，計算活菌數(shù)Ni，反復凍融1～3個循環(huán)，按式(1)計算酵母菌的存活率。

(1)

式中：

P——第i個凍融循環(huán)的存活率，%；

i——凍融循環(huán)數(shù)；

Ni——第i個凍融循環(huán)活菌數(shù)，CFU/mL；

N0——初始活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.5 鰱魚酶解產(chǎn)物對酵母菌的抗凍保護能力分析

(2) 酶解產(chǎn)物濃度對酵母菌存活率的影響：稱取酶解30 min 的鰱魚酶解產(chǎn)物，按1.2.5(1)的方法制備含終濃度為2%，4%，6%，8%酶解產(chǎn)物的酵母菌懸液，置于-20 ℃冰箱進行1個凍融循環(huán)，取出以涂布法進行平板稀釋計數(shù)，計算酵母菌的存活率，確定酶解產(chǎn)物的濃度。

表1 制膠配方Table 1 Gel composition and preparation method for tricine-SDS-PAGE

2 結(jié)果與分析

2.1 鰱魚酶解產(chǎn)物的制備

不同酶解時間的鰱魚酶解產(chǎn)物的基本組成見表2。由表2 可知，隨著酶解時間的延長，其水解度增加，但不同水解度酶解產(chǎn)物的水分、灰分、蛋白質(zhì)(凱式定氮法)的含量區(qū)別不大。

2.2 酵母菌的抗凍性能

酵母菌經(jīng)過凍融處理后的生長情況和存活率見圖1。由圖1可見，經(jīng)過1個凍融循環(huán)處理后存活率僅有0.69%，第3個凍融循環(huán)存活率幾乎為零，表明在沒有保護劑的條件下面包酵母菌極不耐凍，要使其在冷凍后仍然維持存活，添加抗凍保護劑非常必要。

2.3 不同酶解產(chǎn)物對酵母菌的抗凍保護活性

酵母菌液中加入酶解不同時間制備的酶解產(chǎn)物，經(jīng)過凍融處理后其生長情況和存活率見圖2。由圖2可見，甘油對酵母菌的抗凍保護效果明顯，凍融循環(huán)后其存活率達63.5%；酶解產(chǎn)物組中酵母菌的生長情況及存活率都不及甘油組，但均高于空白組，表明不同酶解產(chǎn)物均對酵母菌有一定的抗凍保護作用。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是：冷凍過程中，細胞間隙中的水分首先形成冰晶，導致細胞間隙的蒸氣壓下降，形成細胞內(nèi)外蒸氣壓差，在此作用下，細胞內(nèi)水分外滲，細胞質(zhì)濃度增大，進一步造成酶系統(tǒng)失活，細胞受損[16]；同時胞內(nèi)冰晶的形成也會損傷細胞膜，導致細胞死亡[17]。鰱魚酶解產(chǎn)物具有抑制重結(jié)晶的作用，可減少冷凍過程中冰晶的形成，因而添加酶解產(chǎn)物后酵母菌的存活率增加[17]；其中酶解15，30 min制備的鰱魚酶解產(chǎn)物對酵母菌的抗凍保護效果較好，其存活率分別為22.91%，21.01%，隨著酶解時間的延長，其抗凍保護活性逐漸降低?？紤]到15，30 min酶解產(chǎn)物的抗凍效果相差不大，而30 min酶解產(chǎn)物的色澤和溶解性優(yōu)于15 min酶解產(chǎn)物，故選用30 min酶解產(chǎn)物為后續(xù)的研究對象。

表2鰱魚酶解產(chǎn)物的水解度和基本組成
Table 2 Degree of hydrolysis and composition of the enzymatic hydrolysates from silver carp

圖1 凍融循環(huán)次數(shù)對酵母菌生長情況及存活率的影響Figure 1 Effect of freeze-thaw cycles on the growth of yeast and its survival rate

2.4 酶解產(chǎn)物濃度對酵母菌凍融存活率的影響

將30 min的酶解產(chǎn)物以終濃度為2%，4%，6%，8%的比例加入酵母菌懸液，凍融處理后分析其存活率，結(jié)果見圖3。由圖3可見，隨著酶解產(chǎn)物濃度的增加，酵母菌的存活率顯著增加，濃度為4%時，酵母菌的存活率達到90.73%，較陽性對照(8%甘油)提高了42.88%，說明4%的酶解產(chǎn)物對酵母菌的抗凍保護作用較好；酶解產(chǎn)物濃度繼續(xù)增加到6%，8%時，酵母菌的存活率有所降低，可能與體系滲透壓增大導致的細胞代謝損傷有關(guān)[18]，但存活率仍大于80%，遠優(yōu)于陽性對照組(8%甘油)。

圖2 添加不同酶解產(chǎn)物對酵母菌生長情況和存活率的影響Figure 2 Effect of different enzymatic hydrolysates on the growth of yeast and its survival rate

圖3 酶解產(chǎn)物濃度對酵母菌生長情況及存活率的影響Figure 3 Effect of concentration of enzymatic hydrolysates on the growth of yeast and its survival rate

2.5 酶解產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE分析

用Tricine-SDS-PAGE對不同時間鰱魚酶解產(chǎn)物的分子量分布進行分析，結(jié)果見圖4。由圖4可見，與酶解前鰱魚蛋白(0 min)相比，酶解產(chǎn)物的條帶分布發(fā)生了較大變化。鰱魚蛋白的電泳條帶主要分布在16 kDa以上，尤其是40 kDa以上的區(qū)域，表明未酶解的鰱魚蛋白分子量較大；而酶解產(chǎn)物的蛋白條帶基本相似，且主要分布在16 kDa以下，隨著酶解時間的延長，條帶逐漸減弱，水解240 min后，條帶已非常微弱，表明酶解過程中大分子量蛋白部分被逐漸水解為小分子量蛋白、肽或氨基酸[19]。此外，酶解開始后，在約13 kDa附近新增一條明顯條帶(圖4箭頭處)，其信號隨著酶解時間的延長呈逐漸減弱趨勢，與圖2中其抗凍保護效果的趨勢基本一致，推測該組分很可能與酶解產(chǎn)物的抗凍保護活性有重要關(guān)系，但還需要進一步的試驗驗證。

3 結(jié)論

本研究通過復合蛋白酶有限酶解制備一系列不同酶解時間的鰱魚酶解產(chǎn)物，分析了其對面包酵母菌的抗凍保護活性。結(jié)果表明，面包酵母耐凍性能較差，經(jīng)過1個凍融循環(huán)處理后存活率僅有0.69%，而添加酶解產(chǎn)物能明顯提高其冷凍存活率，其中酶解15，30 min 的酶解產(chǎn)物對酵母菌的抗凍保護效果最好，進一步研究表明，添加4%的30 min酶解產(chǎn)物能使酵母菌的冷凍存活率提高到90.73%，優(yōu)于目前公認的對微生物抗凍保護效果較好的甘油。Tricine-SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，酶解產(chǎn)物的蛋白條帶分布基本相似，條帶信號隨著酶解時間的延長逐漸減弱，其中新增了一條大約13 kDa的條帶，可能與酶解產(chǎn)物的抗凍保護活性有重要關(guān)系，但還需要進一步的試驗驗證。本研究表明鰱魚酶解產(chǎn)物可作為一種天然抗凍劑用于提高酵母菌在速凍和解凍過程中的存活率，為增強冷凍面團中酵母菌的耐凍性提供了試驗依據(jù)。

圖4 不同時間鰱魚酶解產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE圖譜Figure 4 Comparison of peptide band distribution of different enzymatic hydrolysates

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