張新彧，黃 楊，孫紀(jì)元，徐云云

百草枯對人畜均有很強(qiáng)的毒性，因誤服或自服引起急性中毒屢有發(fā)生，已成為農(nóng)藥中毒致死事件的常見病因[1-2]。由于至今尚無有效解毒藥物[3]，許多治療方法雖取得了一些臨床效果，但中毒死亡率仍較高[4-5]，且絕大多數(shù)存活患者存在肺間質(zhì)纖維化而預(yù)后不良[6]。研究已發(fā)現(xiàn)，百草枯經(jīng)由能量依賴性多胺攝取進(jìn)入肺內(nèi)聚集，形成氧化還原循環(huán),產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，從而誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，打破了自身氧化物及抗氧化物的平衡狀態(tài)；另一方面，各類炎性細(xì)胞的積聚,誘發(fā)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等炎性因子大量分泌，使肺內(nèi)炎性反應(yīng)失控，最終導(dǎo)致肺組織脂質(zhì)過氧化加劇，炎性細(xì)胞浸潤，肺泡上皮細(xì)胞凋亡[7-8]，這些是促使百草枯中毒急性肺損傷(ALI)形成的主要因素。有研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷可以清除O2-及-OH，并對DPPH自由基、脂質(zhì)過氧化物都有抑制作用，且有濃度依賴性[9]。本實驗用虎杖苷對急性百草枯中毒大鼠進(jìn)行治療，尋找切實有效的能緩解百草枯氧化損傷及抑制炎性因子釋放的理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物、藥品及主要試劑 選用清潔級健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(250±20)g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號:SCXK(陜)2014-002,符合國家健康一級動物標(biāo)準(zhǔn)。藥品及試劑為20%百草枯、虎杖苷、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓過氧化物酶(MPO)均由南京建成生物工程研究所提供。TNF-α、IL-6由武漢伊艾博科技有限公司提供。

1.2動物分組及模型制作 SD雌性大鼠60只，隨機(jī)分為正常對照組、染毒組和虎杖苷干預(yù)組，每組20只。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，染毒組和虎杖苷干預(yù)組大鼠均以20%百草枯水劑按25 mg/kg一次性灌胃，建立百草枯中毒模型?；⒄溶崭深A(yù)組在染毒后60 min給予虎杖苷120 mg/kg灌胃，染毒組及正常對照組給予等量1 ml/kg生理鹽水灌胃，每日1次，共3 d。3組大鼠均按照原設(shè)計的時間點(6、24、48、72 h，每次5只)處死，分別收集血清和肺組織標(biāo)本。

1.3觀察指標(biāo)和方法 在不同時間點處死相應(yīng)大鼠，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動脈采血5～8 ml，4℃冰箱放置2 h，3000 r/min，離心10 min，取上清，分裝保存，于-80℃冰箱保存；采用生化法檢測血清中MDA、SOD活性和MPO水平，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中TNF-α和IL-6水平；采血完畢后，每組大鼠同時取出右肺上葉拭干表面血液，精確稱量濕肺重量，再置于60℃烘箱中干燥48 h至重量恒定后，取出再次稱量計算肺干重，確定肺濕干比=肺濕重/肺干重。

2 結(jié)果

2.1肺組織濕干比 染毒組和虎杖苷干預(yù)組肺濕干比重隨著中毒時間延長而逐漸升高，在中毒24、48、72 h時高于正常對照組(P<0.01)?；⒄溶崭深A(yù)組24、48、72 h肺濕干比明顯低于染毒組(P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠不同時間點肺濕干比比較

注:與正常對照組比較,bP<0.01;與染毒組比較,dP<0.01

2.2血清中MDA、SOD和MPO水平 染毒組和虎杖苷干預(yù)組血清MDA、MPO水平在6、24、48、72 h高于正常對照組，血清SOD水平均低于正常對照組(P<0.01)。與染毒組比較，虎杖苷干預(yù)組血清MDA、MPO水平在6、24、48、72 h均明顯降低,血清SOD水平明顯增高(P<0.01)。見表2。

表2 3組不同時間點血清MDA、SOD和MPO水平比較

注:MDA為丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶，MPO為髓過氧化物酶；與正常對照組比較，bP<0.01;與染毒組比較，dP<0.01

2.3血清中TNF-α和IL-6水平 染毒組和虎杖苷干預(yù)組血清中TNF-α和IL-6水平6、24、48、72 h高于正常對照組(P<0.01)；與染毒組比較，虎杖苷干預(yù)組6、24、48、72 h血清中TNF-α和IL-6水平降低(P<0.01)。見表3。

表3 3組不同時間點血清中TNF-α和IL-6水平比較

注:TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-6為白介素-6；與正常對照組比較，bP<0.01;與染毒組比較,dP<0.01

3 討論

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，百草枯主要通過肺泡Ⅱ型細(xì)胞主動轉(zhuǎn)運入肺內(nèi),使肺臟成為百草枯中毒的主要靶器官[10]，從而引起ALI和急性呼吸窘迫綜合征，最終使患者呼吸衰竭是百草枯中毒致死的主要原因[11]。研究發(fā)現(xiàn)，百草枯一旦進(jìn)入人體后，可以逆濃度梯度差主動重吸收到肺，并通過NADH依賴反應(yīng)形成氧化還原循環(huán)，首先導(dǎo)致各種有毒高活性氧自由基(H2O2、O2-、-OH)激增,誘導(dǎo)過度脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成過氧化產(chǎn)物MDA等，造成細(xì)胞膜和線粒體等部位產(chǎn)生損傷，其次,導(dǎo)致SOD及其他還原酶活性的降低和NADH等還原當(dāng)量的耗盡[10]，因而引發(fā)抗氧化防御能力失衡；另一方面，肺組織開始出現(xiàn)如中性粒細(xì)胞等各類炎性細(xì)胞積聚，使肺內(nèi)炎性反應(yīng)失控，最終影響了生物氧化磷酸化，能量合成減少至停止，引起細(xì)胞衰竭，使依賴核苷酸生化反應(yīng)的肺表面活性物質(zhì)無法產(chǎn)生[12]，加速百草枯中毒的肺損傷。

自身氧化物及抗氧化物的平衡狀態(tài)標(biāo)志著正常的氧化應(yīng)激水平。多項百草枯中毒實驗研究結(jié)果表明，MDA是多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物之一,是反映體內(nèi)氧自由基的代謝狀況及組織受自由基攻擊程度可靠指標(biāo)[13],其水平大幅升高，可以間接反映百草枯中毒肺損傷的程度[14]；SOD是機(jī)體二級抗氧化酶系統(tǒng)的標(biāo)志物，具有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化的作用，其活性下降反映機(jī)體抗氧化防御能力的降低[15]；MPO主要存在于多形核白細(xì)胞的嗜天青顆粒中，其活力是反映機(jī)體內(nèi)中性粒細(xì)胞活化、浸潤的可靠指標(biāo),升高可啟動脂質(zhì)過氧化，能夠較好反映致百草枯中毒早期肺部炎癥的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程[16]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，染毒組血清中MDA、MPO水平顯著升高，SOD水平顯著降低。提示百草枯中毒后早期氧自由基的清除能力下降，提示染毒動物模型氧化應(yīng)激反應(yīng)較明顯，產(chǎn)生氧自由基而引發(fā)脂質(zhì)過氧化，使生物膜進(jìn)一步受到MDA攻擊，抗氧化防御能力降低，使得氧化(MDA)-抗氧化(SOD)失衡，符合實驗預(yù)期?，F(xiàn)代藥理學(xué)相關(guān)研究表明，虎杖苷在抗脂質(zhì)過氧化、抗炎免疫、抗肺損傷等方面的藥理作用被證實[9,17]。另有研究報道，虎杖苷能夠明顯抑制炎性細(xì)胞因子的分泌，在體內(nèi)和體外發(fā)揮顯著的抗氧化能力[18]。本研究結(jié)果顯示，與染毒組比較，虎杖苷干預(yù)組血清中MDA、MPO水平均明顯降低，而SOD水平明顯增高，提示虎杖苷對百草枯中毒后肺損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)過程有一定的調(diào)節(jié)作用，可減少體內(nèi)ROS的生成，并可減少各種炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，能有效延緩肺損傷的改變。

近年來,在ALI機(jī)制中,多種類型細(xì)胞及細(xì)胞因子在介導(dǎo)炎癥肺組織損傷過程中所起的作用日益受到重視并成為研究的熱點。王鑫等[19]研究證實了百草枯可介導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生大量的白介素和TNF-α與肺組織的炎癥水平密切相關(guān)。相關(guān)研究證實，TNF-α是體內(nèi)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的啟動因子，其水平的增高，具有觸發(fā)進(jìn)一步炎性反應(yīng)的作用,被稱之為早期炎性反應(yīng)細(xì)胞因子。IL-6具有廣泛的生物學(xué)功能，在炎癥階段通過調(diào)節(jié)輔助淋巴細(xì)胞的活性,趨化粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的積聚,介導(dǎo)炎性反應(yīng)，從而又導(dǎo)致IL-6水平的升高[20-22]。在實驗中，染毒組血清中TNF-α和IL-6水平均高于正常對照組，這是造成肺通透性增高，使肺水腫及透明膜形成，是肺濕干比升高的直接原因，最終導(dǎo)致肺內(nèi)炎性反應(yīng)失控，與ALI的發(fā)生關(guān)系極為密切[23-24]。本研究結(jié)果顯示，虎杖苷干預(yù)組肺濕干比、血清中TNF-α、IL-6水平均明顯下降，再次證實了虎杖苷可在百草枯中毒致ALI中發(fā)揮抗炎、減輕水腫的作用。

綜上所述，氧化應(yīng)激反應(yīng)與炎性因子均參與了百草枯中毒急性肺損傷的過程，虎杖苷干預(yù)后抑制了氧化應(yīng)激反應(yīng)，使得炎性因子的水平降低，這種作用可能與MDA、SOD、MPO和TNF-α、IL-6有關(guān)，因而，虎杖苷對百草枯中毒導(dǎo)致的肺損傷有一定的治療效果，值得進(jìn)一步系統(tǒng)深入研究。

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