焦素敏，傅淑霞，溫麗穎，閆 喆，李紹梅

腎臟功能隨年齡增長而下降，衰老是腎臟疾病進展的重要風險之一。目前導致腎臟衰老的機制仍未完全清楚，在眾多調控因素中氧化應激與腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)起著重要作用[1]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)為RAS系統(tǒng)的主要效應因子，已證實AngⅡ可以刺激內皮細胞、血管平滑肌細胞和血管成纖維細胞過氧化物的產生，導致氧化應激[2-4]。氧化應激是造成衰老的主要因素之一，其中自由基和活性氧(ROS)在生物大分子的氧化中起著重要的作用[5]，抑制氧化應激及AngⅡ受體信號途徑可減輕年齡相關的高血壓和代謝異常[6]。氯沙坦為AngⅡ的Ⅰ型受體拮抗劑,可阻斷AngⅡ與其Ⅰ型受體結合,從受體水平拮抗其生物學效應,從而降低腎小球毛細血管內壓,改善腎血流動力學異常,緩解早期的高濾過、高灌注狀態(tài),減少尿蛋白,保護腎功能。既往研究證明，氯沙坦能夠改善老年冠心病患者內皮功能[7]，可以抑制結締組織生長因子(CTGF)、纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)的表達,抑制細胞外基質的積聚,從而延緩D-半乳糖致大鼠腎臟的衰老[8]，而在急性冠狀動脈綜合征患者中，氯沙坦可減輕微粒誘導的內皮細胞的衰老[3]。氯沙坦作為AngⅡ的Ⅰ型受體拮抗劑，在各種原發(fā)及繼發(fā)腎臟疾病中廣泛應用，然而其是否可以減輕系膜細胞的衰老，及其可能的作用機制尚不清楚。本研究通過本課題組前期所建立的人腎小球系膜細胞衰老模型,即：培養(yǎng)至5～8代的細胞，用10-6mol/L AngⅡ刺激72 h[9]，觀察氯沙坦對AngⅡ誘導的人腎小球系膜細胞(HMCs)衰老的影響,細胞內ROS的變化,并測定p53、p21蛋白的表達,探討氯沙坦保護HMCs衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 HMCs購于美國Sciencen公司。細胞在系膜細胞專用培養(yǎng)基(MsCM, ScienCell, USA)中培養(yǎng)，培養(yǎng)至5～8代的細胞用于實驗。氯沙坦(德國Merck公司)，AngⅡ(美國Sigma公司),細胞衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和ROS檢測試劑盒(中國碧云天)。小鼠抗人多克隆抗體β-actin,p21,兔抗人多克隆抗體P53(美國Santa Cruz)。

1.2實驗分組和處理 對照組:在不含AngⅡ的MsCM培養(yǎng)液中培養(yǎng)；Ang組:10-6mol/L AngⅡ刺激細胞72 h；氯沙坦+AngⅡ組:AngⅡ加入前l(fā) h加入10-5mol/L氯沙坦培養(yǎng)72 h。AngⅡ和氯沙坦的刺激濃度和時間由前期實驗所得[9]。

1.3SA-β-gal染色 各組細胞培養(yǎng)72 h后，PBS清洗細胞1次，按試劑盒說明書進行操作，染色后于37℃無CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，衰老的細胞染色后呈藍綠色，鏡下隨機選取6個視野分別計數(shù)衰老細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算SA-β-gal陽性細胞的百分率。

1.4流式細胞儀檢測細胞周期 各組細胞培養(yǎng)72 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化制成單細胞懸液。60 g/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次。加入70%冷乙醇4℃固定過夜，離心去乙醇。PBS洗2次后，懸浮于0.5 ml PBS中，分別加入RNaseA和PI 4℃避光顯色30 min上流式細胞儀對細胞周期進行檢測及分析。

1.5流式細胞儀檢測細胞內ROS 參照碧云天試劑盒說明書操作，即按1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋熒光探針DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。各組細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為1×106～2×108/ml，37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。流式細胞儀檢測細胞內ROS水平。

1.6蛋白免疫印跡法檢測p53、p21蛋白表達 各組細胞培養(yǎng)至相應時間后，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白加含β-巰基乙醇的上樣緩沖液，并于沸水中煮5 min，用12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離。電泳后電轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，加兔抗人p53多克隆抗體(1∶400)，鼠抗人多克隆抗體β-actin(1∶500)，p21(1∶200)4℃搖床過夜，1×TBST洗膜3次，加二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶8000)，山羊抗鼠IgG(1∶8000)孵育雜交，室溫2 h,將ECL(增強化學發(fā)光)試劑盒中的A液和B液等量混合，滴加于膜上，反應1 min后，在發(fā)光儀上發(fā)光。

2 結果

2.1細胞SA-β-gal染色變化 對照組、AngⅡ處理組和氯沙坦干預組SA-β-gal染色陽性細胞百分率分別為(13.03±0.96)%、(80.64±1.34)%、(29.37±0.78)%。對照組和氯沙坦干預組SA-β-gal染色陽性細胞百分率低于AngⅡ處理組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

2.2細胞周期變化 對照組、AngⅡ處理組和氯沙坦干預組G0/G1期細胞比例分別為(52.81±2.53)%、(77.18±1.11)%和(60.6±0.80)%。對照組、氯沙坦干預組G0/G1期細胞比例低于AngⅡ處理組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 3組人腎小球系膜細胞細胞周期變化

2.3細胞內ROS水平變化 AngⅡ處理組人腎小球系膜細胞ROS水平高于對照組和氯沙坦干預組(P<0.05)。見圖3。

圖3 3組人腎小球系膜細胞細胞內活性氧含量變化

2.4p53和/p21蛋白表達水平的變化 AngⅡ處理組p53和/p21蛋白較對照組增高，氯沙坦干預組低于AngⅡ處理組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 3組人腎小球系膜細胞p53和/p21蛋白表達水平

3 討論

許多年齡相關疾病(age-related disease， ARD)包括心腦血管疾病、神經退行性變、腎臟疾病等發(fā)病率也在逐年增高。其中腎臟是受年齡影響比較明顯的器官之一，腎小球濾過率(GFR)隨年齡增長每年下降0.40～1.02 ml/min[10],老年腎臟疾病正逐漸成為影響人們健康和社會發(fā)展的主要疾病，因此研究腎臟衰老機制及研發(fā)干預藥物具有重要意義。

關鍵細胞的衰老是器官和組織衰老的病理基礎，腎小球系膜細胞作為腎臟重要的固有細胞，其表型和功能的改變在腎臟衰老進程中必然發(fā)揮著重要的作用。多數(shù)正常細胞在體外培養(yǎng)時不能無限傳代，而是經過一個時期的增殖后，分裂速度降低，最后停止，對任何有絲分裂原無反應，稱為“復制性衰老”。有研究報道，正常細胞在各種應激下，如DNA損傷、氧化應激、癌基因激活等，可以快速進入衰老，稱為“應激性衰老”[11]。有關衰老機制的假說和理論眾多，如基因功能紊亂、線粒體損傷和干細胞耗竭等[12]。然而，目前最公認的衰老學說之一仍是氧化應激學說。在正常情況下，機體處于氧化與抗氧化的動態(tài)平衡狀態(tài)，從而保護機體免受損傷。隨著年齡增長或在外界有害刺激因素下，機體內ROS的數(shù)量會顯著增多，造成脂質過氧化反應，引起機體內包括蛋白、核酸等的氧化損傷，對細胞功能和活性造成損害，可以說衰老是自由基損傷性效應的綜合結果[13-14]。多種分子通路參與調控衰老的過程，如MAPK/NF-kB通路、抑癌基因PTEN、Klotho蛋白等[15-17]，但是現(xiàn)公認各種誘發(fā)細胞衰老的信號最后主要通過p53-p21-PRb途徑和p16-PRb途徑導致衰老[18]，細胞衰老后具有細胞周期阻滯于G0/G1期、SA-β-gal表達增加等特征性改變。

p53蛋白不僅是重要的細胞周期、凋亡調節(jié)因子，還是細胞衰老過程中重要的調節(jié)因子，能感知衰老相關信號的刺激，如端粒縮短、DNA損傷等。p53被激活時結合到DNA特殊的序列上并增強其下游靶基因的表達。p53活化的一個主要效應分子就是p21，p21蛋白為廣譜的細胞周期蛋白,是依賴于細胞周期蛋白激酶(CDK)的抑制物，p21水平上調可抑制CDK2和CDK4的活性,使其不能磷酸化視網膜母細胞瘤抑制蛋白(Rb)，Rb是CDK4-6/D激酶的主要底物，處于非磷酸化或低磷酸化形式的Rb可與轉錄因子E2F結合，屏蔽其轉錄激活結構域，抑制其轉錄活性，而后者能激活重要的細胞周期蛋白E和A，啟動DNA復制，從而抑制了從G1期進入S期所需的下游基因的表達，使細胞周期停滯[16]。

有研究證實，RAS系統(tǒng)參與器官衰老過程[19-20],血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)可降低腎小球內壓和蛋白尿，減輕局灶節(jié)段性腎小球硬化和間質纖維化。氯沙坦作為血管緊張素受體拮抗劑經典藥物之一，廣泛用于各種腎臟疾病，但對于其在腎小球系膜細胞衰老中的作用報道尚少。

本實驗應用AngⅡ刺激HMCs，成功建立HMCs衰老模型，衰老細胞中p53、p21蛋白表達增多，說明p53/p21通路參與了AngⅡ誘導的HMCs的衰老過程，應用氯沙坦干預后，細胞內ROS水平降低，p53、p21表達下降，提示氯沙坦可能通過減輕氧化應激，調控p53/p21通路而延緩HMCs的衰老過程，為臨床應用氯沙坦治療衰老相關性腎臟疾病提供了理論依據,但是具體應用到臨床還有待于基礎研究的進一步深入和大規(guī)模的臨床實驗來證實。另外，至于P16-PRb通路是否也參與了AngⅡ誘導的HMCs的衰老過程亦需要進一步證實。

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