宋健，張會敏

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床藥物治療的主要手段，遵循中醫(yī)“理法方藥”理論確立，按照“君臣佐使”結(jié)構(gòu)組成，形式上表現(xiàn)為藥物組合，內(nèi)涵上反映了中醫(yī)藥理論。如果說療效是方劑配伍的結(jié)果，那么物質(zhì)基礎(chǔ)則是方劑產(chǎn)生療效的根本。中藥復(fù)方配伍的優(yōu)勢在于方中各藥配伍后可起到協(xié)同或拮抗的作用，從而對機(jī)體進(jìn)行整體調(diào)節(jié)，其化學(xué)成分并不等于單味藥化學(xué)成分的簡單相加，配伍使原有的某些成分發(fā)生了量的變化或是產(chǎn)生了新的化合物，使配伍表現(xiàn)出了減毒、增效甚至產(chǎn)生單味藥不具備的藥理活性。銀翹散出自清代醫(yī)家吳鞠通所著《溫病條辨》上焦篇，由金銀花、連翹、牛蒡子、荊芥穗等10味中藥組成[1]?，F(xiàn)代研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了銀翹散大量的活性成分，為解析復(fù)方的組成做出了巨大貢獻(xiàn)[2-4]。盡管如此，現(xiàn)階段中藥復(fù)方化學(xué)成分研究依然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。總體而言，明確化學(xué)成分是解析方劑配伍工作的前提基礎(chǔ)，是考察中藥復(fù)方化學(xué)反應(yīng)、藥物代謝和藥效機(jī)制的前提[5]。

在項(xiàng)目組前期研究的基礎(chǔ)上[6]，本文利用能夠體現(xiàn)中醫(yī)藥理論整體觀特色的UPLC指紋圖譜技術(shù)，對銀翹散及其各單味藥水提物進(jìn)行UPLC指紋圖譜研究，并利用對照品對照、指紋圖譜處理軟件對各UPLC指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析銀翹散中各主要化學(xué)成分的來源藥材，為進(jìn)一步詮釋銀翹散物質(zhì)基礎(chǔ)及組方配伍原理奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate 3000 XRS UPLC，Thermo(250 mm×4.6 mm，5 μm)C18柱；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)；XS205 DualRange 電子天平(METTLER TOLEDO)；0.45 μm微孔濾膜、0.21 μm針頭濾器(Thermo)；Milli-Q超純水儀(德國Millipore公司)。

1.2 材料

銀翹散組方各單味藥(組方配比：連翹30 g、金銀花30 g、桔梗18 g、薄荷18 g、竹葉12 g、生甘草15 g、荊芥穗12 g、淡豆豉15 g、牛蒡子18 g、蘆根15 g)飲片均購于北京同仁堂大藥房。連翹為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實(shí)，金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，桔梗為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，薄荷為唇形科植物薄荷MenthahaplocalyxBriq.的干燥地上部分，竹葉為禾本科毛竹屬植物淡竹Phyllostachysnigra(Lodd，ex Lindl.)Munro var.henonis(Mitf.)Stapf ex Rendle等的葉，甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖，荊芥穗為唇形科植物荊芥SchizonepetatenuifoliaBriq.的干燥花穗，淡豆豉為豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的成熟種子的發(fā)酵加工品，牛蒡子為菊科植物牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果實(shí)，蘆根為禾本科植物蘆葦PhragmitescommunisTrin.的新鮮或干燥根莖，由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定。

綠原酸(110753-201314，含量以96.6%計)、連翹苷(110821-201213，含量以95.3%計)、牛蒡苷(110819-201309，含量以95.7%計)、甘草苷(111610-201106，含量以93.7%計)、蘆丁(080-9002，含量以98.0%計)、橙皮苷(110721-201014，含量以95.1%計)購于中國食品藥品檢定研究院，連翹酯苷A(140227，含量以98.0%計)購于成都克洛瑪生物科技有限公司；色譜甲醇(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司出品，批號：501066-09064)；磷酸等。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Thermo(250 mm×4.6 mm，5 μm)C18柱，流動相：甲醇-0.05%磷酸水梯度洗脫；檢測波長：237 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；分析時間：100 min。梯度洗脫條件為0～1 min，1%～2%A；10～30 min，2%～15%A；30～50 min，15%～20% A；50～80 min，20%～40% A；80～100 min，40%～43%A。

2.2 供試品溶液的制備

按銀翹散組方配比稱取適量的粗粉，第一次料液比為1∶10，浸泡半小時，回流提取20 min，補(bǔ)足失重，過濾；第二次料液比為1∶8，回流提取20 min，補(bǔ)足失重，過濾；合并兩次濾液，濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。金銀花、連翹等各單味藥均按照相同提取方法制備供試品溶液。

2.3 對照品的制備

精密稱取各對照品，加適量甲醇溶解配制對照品溶液。綠原酸質(zhì)量濃度為0.50 mg·mL-1、連翹苷質(zhì)量濃度為2.04 mg·mL-1、連翹酯苷A質(zhì)量濃度為1.62 mg·mL-1、牛蒡苷質(zhì)量濃度為1.84 mg·mL-1、甘草苷質(zhì)量濃度為0.60 mg·mL-1、蘆丁質(zhì)量濃度為0.50 mg·mL-1、橙皮苷質(zhì)量濃度為0.50 mg·mL-1。

2.4 指紋圖譜的建立

精密吸取各供試品10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件操作，考察了供試品溶液120 min內(nèi)的色譜分離情況，100～120 min幾乎無色譜峰，故選擇記錄了100 min內(nèi)色譜圖，見圖1。

圖1 銀翹散UPLC指紋圖譜

2.5 方法學(xué)考察

為了考察分析方法的可靠性，以銀翹散為例，對儀器的精密度、方法重復(fù)性以及穩(wěn)定性做了相應(yīng)的考察。

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取銀翹散同一供試品溶液，按照2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，用中藥指紋圖譜相似度計算軟件計算，所得相似度為0.998、0.997、0.999、0.996、0.995、0.999，相似度極高，結(jié)果峰面積占總峰面積10%以上的共有峰峰面積的RSD不超過10%，共有峰保留時間RSD均小于3%，表明精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取銀翹散6份，分別按供試品溶液制備方法制備，分別進(jìn)樣10 μL，按照2.1色譜條件檢測指紋峰，用中藥指紋圖譜相似度計算軟件計算，所得相似度為0.994、0.987、0.995、0.992、0.983、0.985，結(jié)果峰面積占總峰面積10%以上的共有峰峰面積的RSD不超過10%，共有峰保留時間RSD均小于3%，說明方法的重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取銀翹散同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，按照2.1色譜條件檢測指紋峰，用中藥指紋圖譜相似度計算軟件計算，所得相似度為0.998、0.997、0.999、0.996、0.995、0.989，結(jié)果峰面積占總峰面積10%以上的共有峰峰面積的RSD不超過10%，共有峰保留時間RSD均小于3%。

2.6 樣品測定及指紋圖譜軟件分析

取上述供試品各10 μL，按照2.1色譜條件檢測指紋峰，考察100 min內(nèi)色譜分離情況，根據(jù)各活性組分及單味藥在特征指紋圖譜中色譜保留時間信息，從而實(shí)現(xiàn)相同的實(shí)驗(yàn)條件下所得的色譜指紋圖譜中單味藥與復(fù)方活性組分的相對歸屬分析。采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》A版對各組圖譜進(jìn)行比對分析，銀翹散UPLC與各對照品、銀翹散與各單味藥UPLC指紋圖譜匹配圖，見圖2～3；銀翹散UPLC與各單味藥及各對照品指紋圖譜匹配數(shù)據(jù)見表1。

圖2 銀翹散與各對照品UPLC指紋圖譜匹配圖

圖3 銀翹散與各單味藥UPLC指紋圖譜匹配圖

編號保留時間/min峰面積來源藥材編號保留時間/min峰面積來源藥材13 157477602 0—1874 075375609 5連翹24 581243638 8—1975 0423870303 0金銀花、連翹、竹葉34 989240168 8—2077 0921535929 0金銀花、薄荷417 958456877 4—2178 999564877 7金銀花、薄荷、甘草537 432313422 7金銀花、薄荷、牛蒡子2280 341362542 9甘草(甘草苷)642 369278859 1—2382 558419067 0金銀花、連翹

表1(續(xù))

注：“—”未歸屬。

3 討論

3.1 樣品制備

《溫病條辨》中記載銀翹散煎煮方法為“上杵為散，每服六錢，鮮葦根湯煎，香氣大出，即取服，勿過煮”。結(jié)合古今文獻(xiàn)對煎煮方法的記載和報道，本文所建立的指紋圖譜是在前期優(yōu)選的色譜條件下建立的[6]，其中綠原酸、連翹苷、連翹酯苷A、牛蒡苷等主要藥效成分均有明確的抗流感病毒作用[7-9]。

3.2 成分峰歸屬

通過采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》A版對各組圖譜進(jìn)行比對分析(見圖2～3)，對銀翹散水提物中34個主要成分峰的原藥材來源進(jìn)行了歸屬，并與對照品圖譜比對歸屬了7個成分(見表1)。由表1可見，在銀翹散水提物的34個主要成分峰中，有18個成分峰來源于君藥金銀花，8個成分峰來源于連翹，5個成分峰來源于薄荷，各有4個成分峰來源于荊芥、牛蒡子、竹葉，3個成分峰來源于甘草，未檢測到來源于淡豆豉、蘆根、桔梗3味藥的成分峰。分析原因可能為淡豆豉、蘆根、桔梗在水提液中溶出的成分含量較低，不能被檢測到。此外，銀翹散中仍有6個成分峰沒有歸屬來源，這6個峰在銀翹散水提液中被檢測到，但未在任何單味藥水提液中檢測到。大量文獻(xiàn)研究證實(shí)，方劑配伍能夠改變復(fù)方化學(xué)成分[5]。本研究結(jié)果為進(jìn)一步對銀翹散藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究及組方配伍原理的闡釋提供了參考。

[1] 謝鳴.方劑學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.

[2] 石鉞，石任兵.銀翹散抗流感病毒有效部位各組分變化及歸屬分析[J].藥學(xué)學(xué)報，2007，42(2)：192-196.

[3] 石鉞，石任兵，劉斌，等.銀翹散抗流感病毒有效部位群化學(xué)成分的分離與鑒定[J].中國中藥雜志，2003，28(1)：43-47.

[4] 石鉞，石任兵，劉斌，等.銀翹散抗流感病毒有效部位群中的黃酮二糖苷[J].中草藥，2003，34(8)：676-678.

[5] 徐硯通.方劑配伍的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵探討[J].中草藥，2015，46(4)：465-469.

[6] 張會敏，曲新燕，張照研，等.銀翹散不同復(fù)方配伍HPLC指紋圖譜研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21(10)：47-50.

[7] Li L，Chang S H，Xiang J F，et al.Screen anti-influenza lead compounds that target the PA(C)subunit of H5N1 viral RNA polymerase[J].PLoS One，2012，7(8)：1-7.

[8] Zhong W T，Wu Y C，Xie X X，et al.Phillyrin attenuates LPS-induced pulmonary inflammation via suppression of MAPK and NF-κB activation in acute lung injury mice[J].Fitoterapia，2013，90(6)：132-139.

[9] Hayashi K，Narutaki K，Nagaoka Y，et al.Therapeutic effect of arctiin and arctigenin in immunocompetent and immunocompromised mice infected with influenza A virus[J].Biol Pharm Bull，2010，33(7)：1199-1205.