曲繼旭，賀雨馨，孫志蓉*，蘇娟，廖曉康，楊繼勇

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.貴州省赤水市信天中藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司，貴州 赤水 564700)

石斛屬(DendrobiumSw.)為蘭科第二大屬，包括約1000種植物，截止目前我國記載的石斛共74種2變種，產(chǎn)于秦嶺以南諸省區(qū)，尤其云南南部為多[1]。其中，金釵石斛DendrobiumnobileLindl.、鼓槌石斛DendrobiumchrysotoxumLindl.和鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo.已列入2015年版《中華人民共和國藥典》[2]，紫皮石斛DendrobiumdevonianumPaxt.因野生及栽培產(chǎn)量較大，質(zhì)量類似鐵皮石斛，具有很大的開發(fā)空間[3]。中藥石斛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并列為上品，常用于熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱等病癥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明石斛還具有抗衰老、增強(qiáng)免疫力等作用[4]，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材。近年來，石斛花被人們開發(fā)成保健品，以花茶形式飲用，研究者們已對部分石斛花的揮發(fā)性成分進(jìn)行了研究[5-6]，但有關(guān)石斛花營養(yǎng)價(jià)值及紫皮石斛花揮發(fā)性成分未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以金釵、鼓槌、鐵皮和紫皮4種石斛花為材料，采用氨基酸自動分析法和氣質(zhì)聯(lián)用色譜技術(shù)對其營養(yǎng)價(jià)值及揮發(fā)性成分進(jìn)行分析比較，以期為石斛花的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用石斛花樣品經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)孫志蓉教授鑒定為蘭科石斛屬植物金釵石斛DendrobiumnobileLindl.(貴州赤水市信天中藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司提供)、鼓槌石斛DendrobiumchrysotoxumLindl.(云南德潤康股份有限公司提供)、鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimuraetMigo.(浙江杭州小香生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供)、紫皮石斛DendrobiumdevonianumPaxt(湖北林科院提供)的干燥花。

1.2 儀器

日立L-8900型氨基酸自動分析儀；美國Agilent 7890A/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀，萃取針材質(zhì)：ACAR/PDMS/DVB；METTLER-AE240型1/100000電子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

2 方法

2.1 氨基酸測定方法

稱取一定質(zhì)量的樣品(含50 mg蛋白)于20 mL的水解管中，加入16 mL 6mol·L-1的鹽酸溶液，真空脫氣30 min，充氮封管，在110 ℃下水解22～24 h取出，取出冷卻開管，用去離子水無損轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，并定容。準(zhǔn)確量取1 mL水解液于小瓶中，于真空中脫酸抽干，加1 mL水再抽干，再加1 mL水再抽干備用。采用日立L-8900氨基酸分析儀(2622#PH離子交換色譜柱，60 mm×4.5 μm；柱溫為57 ℃；柱后衍生，衍生反應(yīng)溫度為135 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；流速：衍生試劑為0.35 mL·min-1，緩沖液為0.4 mL·min-1)進(jìn)行氨基酸含量檢測，上機(jī)前準(zhǔn)確加入1 mL 0.02 mol·L-1的鹽酸溶液充分溶解，后用0.22 μm的水相濾膜過濾后，進(jìn)行上機(jī)分析。由于采用酸水解法處理樣品，因此本實(shí)驗(yàn)不考慮色氨酸的檢測。

2.2 營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)方法

參照Bano方法計(jì)算氨基酸評分值(Amino Acid Score，AAS)[7]，參照FAO推薦的方法測定化學(xué)評分(Chemical Score，CS)[8]，參照朱圣陶等[9]研究方法計(jì)算氨基酸比值(ratio of amino acid,RAA)、氨基酸比值系數(shù)(RC)和氨基酸比值系數(shù)分(SRC)。

AAS=待測蛋白中某種必需氨基酸含量(mg·g-1)/FAO評分模式某種氨基酸含量(mg·g-1)

(1)

CS=待測蛋白中某種必需氨基酸含量(mg·g-1)/雞蛋評分模式中該種氨基酸含量(mg·g-1)

(2)

RAA=待測蛋白質(zhì)氨基酸含量/FAO評分模式氨基酸含量

(3)

RC=氨基酸比值/氨基酸比值之均數(shù)

(4)

SRC=100-CV×100

(5)

式中：CV是RC的變異系數(shù)，CV=標(biāo)準(zhǔn)差/均數(shù)。

2.3 揮發(fā)性成分測定方法

2.3.1 GC條件 色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氦氣，流速為1 mL·min-1，分流，分流比為5∶1；進(jìn)樣溫度為250 ℃，柱箱溫度為40 ℃；按程序升溫(起始溫度為40 ℃，保持2 min；以5 ℃·min-1升至160 ℃，保持0 min；以8 ℃·min-1升至250 ℃，保持10 min：總用時(shí)50.25 min)。

2.3.2 MS條件 EI電離源，能量為70 eV，倍增電壓為1800 V；離子源溫度為230 ℃，接口溫度為250 ℃，四級桿溫度為150 ℃，掃描范圍為m/z40～400，間隔0.3 s。

2.3.3 樣品測定 樣品研碎加入20 mL頂空瓶中，至瓶身一半位置，蓋緊瓶蓋。插入ACAR/PDMS/ DVB萃取頭，于70 ℃下萃取50 min后，將萃取頭插入氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣口，在250 ℃進(jìn)樣口解吸5 min，進(jìn)行分析。采集到的質(zhì)譜圖利用計(jì)算機(jī)譜庫進(jìn)行檢索，鑒定樣品中的揮發(fā)性成分，并用峰面積歸一化法分析各成分的相對含量，檢索譜圖庫為NIST 08。

3 結(jié)果與分析

3.1 4種石斛花蛋白的氨基酸組分比較

由表1可知，4種石斛花均含17種氨基酸(色氨酸未測)，其中均包括人體所必需氨基酸7種，但氨基酸含量存在差異，其氨基酸總量(TAA)排序?yàn)樽掀?鼓槌>鐵皮>金釵。植物必需氨基酸的種類、含量及組成比例是評價(jià)氨基酸營養(yǎng)價(jià)值優(yōu)劣的重要指標(biāo)，根據(jù)FAO/WHO建議的理想蛋白條件：必需氨基酸/總氨基酸的值(EAA/TAA)應(yīng)在40%左右，必需氨基酸/非必需氨基酸的值(EAA/NEAA)應(yīng)在60%以上。數(shù)據(jù)表明4種石斛花EAA/TAA值排序分別為金釵>紫皮>鐵皮>鼓槌，除鼓槌石斛花外，其余石斛花均在40%左右。而EAA/NEAA值排序?yàn)榻疴O>紫皮>鐵皮>鼓槌，EAA/TAA值同樣是除鼓槌石斛花外，其余石斛花均大于60%。該結(jié)果表明金釵、紫皮和鐵皮3種石斛花符合優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。金釵、紫皮和鐵皮3種石斛花EAA含量最高的均為亮氨酸，而鼓槌石斛花則以蘇氨酸最高；所含的蛋氨酸均最低。金釵、紫皮和鐵皮3種石斛花NEAA含量最高的均為谷氨酸，而鼓槌石斛花則以天冬門氨酸最高；所含的胱氨酸含量均最低。

表1 4種石斛花蛋白的氨基酸組成

注：*為必需氨基酸；**為半必需氨基酸。

3.2 4種石斛花蛋白的營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)

植物蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值與蛋白質(zhì)含量、氨基酸種類含量和EAA所占比例等相關(guān)，目前國際上均以FAO/WHO推薦的必需氨基酸模式和標(biāo)準(zhǔn)雞蛋蛋白的必需氨基酸模式作參比，下面采用4種非生物學(xué)指標(biāo)對4種石斛花蛋白進(jìn)行營養(yǎng)價(jià)值的評價(jià)，可以更好地闡述不同石斛花蛋白的營養(yǎng)價(jià)值。

3.2.1 氨基酸評分(AAS)和化學(xué)評分(CS) 4種石斛花的AAS和CS見表2。AAS值表示被測蛋白與FAO標(biāo)準(zhǔn)蛋白的接近程度，CS值表示待測蛋白與標(biāo)準(zhǔn)雞蛋蛋白的接近程度，AAS值和CS值越接近1，說明待測蛋白與模式蛋白越接近，氨基酸營養(yǎng)價(jià)值越高。由表2可知，金釵、鐵皮、紫皮3種石斛花的AAS總評分和CS總評分更接近于1，但數(shù)值相近，說明這3種石斛花的必需氨基酸模式均能夠滿足人體需求，營養(yǎng)價(jià)值均較高。當(dāng)以FAO模式的AAS為參考標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，AAS最小的氨基酸為第一限制氨基酸，由表2可知，4種石斛花的第一限制氨基酸均為蛋氨酸+胱氨酸(Met+Cys)；當(dāng)以全雞蛋蛋白模式的CS為參考標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，CS最小的氨基酸為第一限制氨基酸，由表2可知，4種石斛花的第一限制氨基酸均為蛋氨酸+胱氨酸；綜合表明4種石斛花的第一限制氨基酸均為蛋氨酸+胱氨酸。

3.2.2 氨基酸比值系數(shù)(RC)和氨基酸比值系數(shù)分(SRC) RC是根據(jù)氨基酸平衡理論，利用WHO/FAO的氨基酸模式進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)量評價(jià)。RC表示與模式氨基酸相當(dāng)量的待測蛋白氨基酸的比值，若待測蛋白氨基酸組成與氨基酸模式一致，則RC都應(yīng)等于1，RC>1表示該氨基酸相對過剩，RC<1表示該氨基酸相對不足，RC最小的氨基酸為第一限制氨基酸。由表3可知，4種石斛花的第一限制氨基酸均為蛋氨酸+胱氨酸?，F(xiàn)代研究認(rèn)為氨基酸不足影響蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值，氨基酸過剩也會限制氨基酸的營養(yǎng)價(jià)值，SRC是采用各種必需氨基酸偏離氨基酸模式的離散度來評價(jià)蛋白質(zhì)的質(zhì)量，當(dāng)待測蛋白的RC越分散，表明這些氨基酸在氨基酸平衡上的負(fù)貢獻(xiàn)越大，SRC變小，蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值越差。由表3看出，SRC(金釵)>SRC(紫皮)>SRC(鐵皮)>SRC(鼓槌)，結(jié)果表明金釵石斛花營養(yǎng)價(jià)值最高，紫皮、鐵皮石斛花次之，而鼓槌石斛花最低。

表2 4種石斛花蛋白的氨基酸評分(AAS)和化學(xué)評分(CS)

注：*表示所對應(yīng)的氨基酸為第一限制氨基酸；—表示未檢出。

表3 4種石斛花氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系數(shù)(RC)和氨基酸比值系數(shù)分(SRC)

注：*表示所對應(yīng)的氨基酸為第一限制氨基酸。

3.3 4種石斛花蛋白的揮發(fā)性成分分析

依據(jù)GC-MS條件對4種石斛花的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，分析鑒定結(jié)果見表4。結(jié)果表明，從金釵、鼓槌、鐵皮和紫皮4種石斛花的揮發(fā)性成分分別鑒定出37、31、26、21種化合物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為63.17%、61.74%、73.72%和53.44%，主要為醛類、烷烴類、酯類、醇類和含氮化合物。其中，金釵、鼓槌、鐵皮和紫皮石斛花共有的揮發(fā)性成分有3種，分別為2，6-二叔丁基對甲酚(鼓槌2.30%，紫皮1.62%，鐵皮0.76%，金釵0.67%)、十四烷(金釵1.23%，鐵皮0.67%，鼓槌0.50%，紫皮0.25%)和十六烷(紫皮3.05%，鐵皮0.92%，金釵0.84%，鼓槌0.48%)。金釵石斛花中乙醇含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)16.06%；其他揮發(fā)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%的化合物有7種，分別是正己烷(5.97%)、順-2，3-二甲基-環(huán)丁酮(4.22%)、1，1′-(2-甲基-1-亞丙烯基)雙-苯(3.71%)、十二烷(3.27%)、十三烷(3.09%)、甲氧基乙酸丁酯(2.51%)和柏木腦(2.49%)。鼓槌石斛花中乙醛含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)27.25%；其他揮發(fā)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%的化合物有5種，分別是偶氮甲烷(11.16%)、甲基醚(3.73%)、頭孢噻肟(3.59%)、2，6-二叔丁基對甲酚(2.30%)和丁氧硫氰醚(2.25%)。鐵皮石斛花中揮發(fā)性成分以乙醛(26.64%)為主；其余質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%的成分有5種，分別為正丁基異氰酸乙酸酯(10.99%)、偶氮甲烷(10.04%)、頭孢噻肟(5.35%)、壬醛(4.19%)和丁氧硫氰醚(3.98%)。紫皮石斛花揮發(fā)性成分中含量較高的成分為頭孢噻肟(16.76%)、乙醛(13.90%)和偶氮甲烷(12.07%)，其余質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%的揮發(fā)性成分為十六烷(3.05%)。

表4 4種石斛花揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果

表4(續(xù))

表4(續(xù))

注：—表示未檢出。

4 結(jié)論與討論

氨基酸是有機(jī)體組織細(xì)胞的基本組成成分，也是生命體合成蛋白質(zhì)的基本原料，且部分氨基酸在生物體內(nèi)還具有一定的生物活性功能[10]。亮氨酸是人體必需氨基酸，除了可參與機(jī)體蛋白質(zhì)、糖脂代謝的調(diào)控，還影響機(jī)體多種激素的分泌，同時(shí)還可作為信號分子參與多種生理功能的維持與調(diào)控[11]；賴氨酸也是必需氨基酸，可參與人體的新陳代謝等生理活動，且當(dāng)食物中賴氨酸的含量不足時(shí)，會限制其他氨基酸的利用[12]。本實(shí)驗(yàn)采用氨基酸自動分析儀測定金釵、鼓槌、鐵皮和紫皮4種石斛花的氨基酸組分，并采用相關(guān)的非生物學(xué)指標(biāo)對其氨基酸進(jìn)行營養(yǎng)評價(jià)；結(jié)果表明，4種石斛花均包含人體所必需的氨基酸7種，金釵、紫皮和鐵皮3種石斛花EAA/TAA值與EAA/NEAA值均符合理想蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，而鼓槌石斛花則低于標(biāo)準(zhǔn)。通過AAS和CS評價(jià)法可知，金釵、紫皮和鐵皮石斛花均符合FAO/WHO模式蛋白，營養(yǎng)價(jià)值較高，但三者數(shù)值接近，營養(yǎng)價(jià)值差異性不高，通過RC和SRC評價(jià)法可知，SRC(金釵)>SRC(紫皮)>SRC(鐵皮)>SRC(鼓槌)，金釵石斛花營養(yǎng)價(jià)值最高，紫皮與鐵皮石斛花次之，鼓槌石斛花最低。通過分析可知，金釵、鐵皮和紫皮石斛花必需氨基酸中亮氨酸含量均最高，鼓槌石斛花中蘇氨酸最高，而蛋氨酸和胱氨酸均為4種石斛花的第一限制氨基酸。故作為食物或飲品用之，可考慮石斛花與其他食物的相互補(bǔ)充。

植物花香主要是由萜烯類、苯型烴類、脂肪酸及其衍生物以及一些含硫、含氮的化合物組成[13]。本研究通過GC-MS分別從紫皮、鼓槌、鐵皮和金釵石斛花的揮發(fā)性成分中分析鑒定出37、31、26、21種化合物，4種石斛花的揮發(fā)性成分僅有3種共有化合物，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)也存在較大差異。其中，金釵石斛花與其他3種花相比，揮發(fā)性成分差異較明顯。鐵皮石斛花所含醛類、酯類、含氮類居多，此結(jié)果與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的結(jié)果差異不大，而與文獻(xiàn)[6]的結(jié)果差異明顯，結(jié)果的差異在極大程度上是因?yàn)殍F皮石斛花的產(chǎn)地所造成的。鼓槌和紫皮石斛花所含的醛類、含氮類成分也較高，而金釵石斛所含的醇類、烷烴類和芳香烴類成分居多。石斛花中所含的部分揮發(fā)性成分不僅具有獨(dú)特的清香氣味，而且具有廣泛的藥理活性。鐵皮石斛花中所含的壬醛含量較高，有強(qiáng)的油脂氣味，具有玫瑰、柑橘等植物的香氣，可用于調(diào)制香料或食品調(diào)料；金釵石斛中的柏木腦具有香氣，可用作香料以及化妝品定香劑[14]；紫皮石斛花含量較高的頭孢噻肟對致病菌生長有著較好的抑制作用[15]。

綜上所述，綜合評價(jià)紫皮、鼓槌、鐵皮和金釵4種石斛花的氨基酸營養(yǎng)價(jià)值，金釵石斛花的營養(yǎng)價(jià)值最好，鐵皮和紫皮石斛花次之，鼓槌石斛花最低；4種石斛花所含的揮發(fā)性成分種類豐富，還具有香氣和廣泛的藥理活性，研究為石斛花的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

[1] 中國科學(xué)院《中國植物志》編輯委員會.中國植物志：第19卷[M].北京：科學(xué)出版社，1999：111.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：92，282.

[3] 順慶生.中藥石斛的新資源——齒瓣石斛(紫皮)[J].中國現(xiàn)代中藥，2011，13(11)：23-24.

[4] 邵曰鳳，胡粉青，鄒澄，等.石斛屬植物化學(xué)成分和藥理活性研究現(xiàn)狀[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24(增刊1)：152-157.

[5] Huo X，Zhou J H，Yang N J，et al.Determination of chemical constituents of essential oil from flower ofDendrobiumcandidumWall.ex Lind.[J].China J Tradit Chin Med Pharm，2008，228(9)：1105-1115.

[6] 李文靜，李進(jìn)進(jìn)，李桂鋒，等.GC-MS分析4種石斛花揮發(fā)性成分[J].中藥材，2015，38(4)：777-780.

[7] Bano Z，Raiarathram S.Pleurotusmushroomas a nutritions food[M]// Chang S T，Quimio T H.Tropical mushroom：Biological nature and cultivation methods. Hongkong：The Chinese University Press，1982：363-380.

[8] 劉素穩(wěn)，張澤生，楊海延，等.馬鈴薯蛋白的營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2008，30(2)：208-210.

[9] 朱圣陶，吳坤.蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)——氨基酸比值系數(shù)法[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào)，1988，1(2)：187-190.

[10] 王洪榮，季昀.氨基酸的生物活性及其營養(yǎng)調(diào)控功能的研究進(jìn)展[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2013，25(3)：447-457.

[11] 呂子全，郭非凡.內(nèi)源性代謝分子—亮氨酸調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2012，43(5)：337-340.

[12] Johnson I L，Carpenter K J，Hurrell R F，et al.Some studies of the nutritive value of high-lysine barleys[J].J Sci Food Agric，2010，29(2)：127-135.

[13] Pichersky E，Noel J P，Dudareva N.Biosynthesis of plant volatiles：nature’s diversity and ingenuity[J].Science，2006，311：808-811.

[14] 張正香，羅小龍.柏樹綜合利用研究概況[J].生物質(zhì)化學(xué)工程，1999(2)：29-31.

[15] 吳楠，吳巧稚，于鋒，等.臨床幾種主要致病菌對頭孢噻肟的耐藥現(xiàn)狀與趨勢[J].中國新藥雜志，2010，19(7)：573-579.