陳銘陽(yáng)，胡小松，許貞，任廣喜，蘆海生，劉春生*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 望京醫(yī)院，北京 100102)

龜甲是一種常用中藥，具有滋陰潛陽(yáng)、益腎強(qiáng)骨、養(yǎng)血補(bǔ)心、固經(jīng)止崩的功效，常用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、頭暈?zāi)垦?、虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)、筋骨痿軟、心虛健忘、崩漏經(jīng)多等癥[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，龜甲具有抗氧化活性[2-3]、提高機(jī)體免疫力[4]、促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化[5-9]等多種藥理作用。已有報(bào)道的活性成分有無(wú)機(jī)元素[10-11]、甾體類(lèi)[12-14]、氨基酸與多肽類(lèi)[15-16]、多酚類(lèi)[17]等。但是，目前龜甲的代表活性成分依然尚不清楚。

中醫(yī)藥的臨床實(shí)踐已經(jīng)有幾千年歷史，但許多已被證明有確切療效的中藥依靠現(xiàn)有的分子醫(yī)學(xué)理論依然無(wú)法給出合理的解釋?zhuān)崾玖酥兴幹写嬖谥粗乃幮C(jī)制。微小核糖核苷酸(micro ribonucleic acid，miRNA)是指一類(lèi)長(zhǎng)度為20～22 nt、能夠調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小分子RNA[18]，其廣泛存在于動(dòng)物、植物體內(nèi)，并通過(guò)與靶基因互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)的方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究表明，miRNA能作為一種信號(hào)分子在不同生命體間傳播，跨物種對(duì)基因表達(dá)起到調(diào)控作用[19]。2011年，張辰宇課題組報(bào)道了一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)，植物miRNAs可以通過(guò)飲食的方式進(jìn)入人體血液和組織，它們可以通過(guò)調(diào)控人體內(nèi)靶基因表達(dá)而影響人體生理功能[20]。2014年，該課題組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)中藥金銀花中的miR2911能在動(dòng)物體內(nèi)傳遞并被吸收，并可通過(guò)靶向調(diào)控PB1、PB2基因抑制H1N1、H5N1、H7N9病毒的復(fù)制來(lái)治療流感[21]。

盡管外源miRNA藥效機(jī)制的相關(guān)研究在植物中已經(jīng)取得一些成果，并有許多相關(guān)文獻(xiàn)的支持[22-24]，但在藥用動(dòng)物中的研究還是空白，龜甲等常用動(dòng)物藥中是否也有穩(wěn)定存在的miRNAs尚不清楚。筆者利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)對(duì)龜甲可能存在活性的功能miRNA進(jìn)行初步篩選，為龜甲及其他動(dòng)物藥中新型活性成分的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

龜甲購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為《中華人民共和國(guó)藥典》所載龜甲正品。烏龜及黃喉擬水龜購(gòu)自廣州水產(chǎn)品市場(chǎng)。樣品信息如表1所示。

表1 龜甲及相關(guān)測(cè)試樣品信息

1.2 總RNA提取

分別取適量龜甲、新鮮烏龜背甲、新鮮黃喉擬水龜背甲，使用無(wú)水乙醇洗凈后搗碎，置于-80 ℃冷凍過(guò)夜后，再在真空低溫冷凍條件下凍干備用。

總RNA的提取選用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)試劑盒，分別提取上述3個(gè)樣品的總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度，Nanodrop檢測(cè)RNA純度以及Agilent2100檢測(cè)RNA完整性。

1.3 miRNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

采用Illumina TruSeq Small RNA試劑盒構(gòu)建龜甲miRNA文庫(kù)。以total RNA為起始樣品，1 μg為起始量，分別在miRNA的3′端和5′端加上接頭，然后使用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增(11～12個(gè)循環(huán))，對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行富集，再采用6% Novex TBE PAGE進(jìn)行文庫(kù)純化。使用TBS380(Picogreen)對(duì)文庫(kù)定量，cBot上進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增后利用Hiseq測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行SE50測(cè)序(由上海美吉生物公司完成)。其流程如圖1所示。

圖1 龜甲miRNA 文庫(kù)構(gòu)建流程

1.4 測(cè)序信息分析

測(cè)序信息分析采用Fastx-Toolkit(http：//hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)與上海美吉生物自主開(kāi)發(fā)軟件，流程圖如圖2所示。

圖2 龜甲測(cè)序信息分析流程圖

1.4.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控和長(zhǎng)度分析統(tǒng)計(jì) 原始數(shù)據(jù)下機(jī)之后，先統(tǒng)計(jì)原始數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)量、堿基質(zhì)量等信息。隨后對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去接頭、去除含未知堿基序列、去低質(zhì)量堿基序列、長(zhǎng)度篩選處理，獲得clean small RNA 序列，并對(duì)高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果(clean reads)進(jìn)行長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)。原始的FASTQ 數(shù)據(jù)里面含有帶接頭、低質(zhì)量的序列(reads)，為了保證后續(xù)生物信息分析的準(zhǔn)確性，需要對(duì)raw reads 進(jìn)行質(zhì)量控制，得到clean reads，之后的生物信息分析會(huì)基于clean reads 進(jìn)行。具體質(zhì)控步驟：1)去除reads 中的3′接頭序列，去除由于接頭自連等原因?qū)е聸](méi)有插入片段的reads；2)剪切3′端測(cè)序質(zhì)量較低的堿基(質(zhì)量值小于20)；3)去除含未知堿基N 的reads；4)去除長(zhǎng)度過(guò)短的reads(<18nt)；5)去除長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)的reads(>32 nt)。

1.4.2 序列去冗余、miRNA鑒定和表達(dá)量統(tǒng)計(jì) 首先，對(duì)clean reads 進(jìn)行相同序列合并(去冗余)處理，這樣可以方便后續(xù)分析。隨后，將去冗余之后的clean reads與Rfam、miRBase的基因組序列比對(duì)，鑒定出已知和新的miRNA分子，分別獲得各自的表達(dá)量即count值。由于烏龜在miRBase中沒(méi)有對(duì)應(yīng)物種的miRNA序列信息，研究中選擇近緣物種海龜?shù)幕蚪M作為參考，若有注釋信息，就用參考基因組中的miRNA序列注釋測(cè)得的miRNA，將其余不能比對(duì)上的sRNA比對(duì)到參考基因組上，截取其周?chē)蛄?，使用軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果利用Dicer酶切位點(diǎn)信息、能量值等特征進(jìn)行過(guò)濾，鑒定出新的miRNA。對(duì)所有已知和新預(yù)測(cè)miRNA進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，并利用Transcripts Per Million(TPM)進(jìn)行表達(dá)量的均一化處理。

1.4.3 靶基因預(yù)測(cè)和功能分析 對(duì)分析得到的已知和新預(yù)測(cè)的miRNA利用miRanda軟件(www.microrna.org)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。由于本研究中主要探究的是龜甲中具有藥效活性的miRNA，因此補(bǔ)充使用TargetScan預(yù)測(cè)工具(www.targetscan.org)對(duì)表達(dá)量較高的miRNA進(jìn)行人轉(zhuǎn)錄組中靶基因預(yù)測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.5.1 引物設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)選用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中count值超過(guò)10 000的miRNA進(jìn)行絕對(duì)定量驗(yàn)證。選定測(cè)試基因后設(shè)計(jì)引物，如表2所示。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 將目的基因合成后克隆到質(zhì)粒中，測(cè)定質(zhì)粒濃度并計(jì)算其拷貝數(shù)，對(duì)照品以0.18 ng·μL-1的初始質(zhì)量濃度進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)總€(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，并繪制擴(kuò)增曲線(xiàn)。以對(duì)照品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)，以測(cè)得的目的基因的Ct值為縱坐標(biāo)(Y)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算得出線(xiàn)性方程。NW-006622633-1-195的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=-3.012X+34.137，r=0.993；NW-006642957-1-500的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=-3.38X+35.568，r=0.998；xtr-mir-22的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=-3.415X+34.446，r=0.993，線(xiàn)性關(guān)系均良好。

1.5.3 絕對(duì)定量拷貝數(shù)計(jì)算 3個(gè)miRNA在各樣品中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)后，根據(jù)其Ct值重合在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上的位置計(jì)算出目的基因在樣品中的絕對(duì)拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 龜甲miRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析

2.1.1 原始數(shù)據(jù) 原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，共產(chǎn)出11 021 113條原始序列，總堿基數(shù)為562 076 763 bp，堿基錯(cuò)誤率為0.010 6%，Phred數(shù)值大于20、30的堿基占總體堿基的百分比分別為99.42%和98.15%，GC含量為55.33%。

表2 龜甲測(cè)序?qū)崟r(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)引物

樣品原始數(shù)據(jù)中堿基質(zhì)量值越高，說(shuō)明測(cè)序錯(cuò)誤率越低。樣品原始數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量分布如圖3所示，所獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)達(dá)到后續(xù)分析要求。

注：橫坐標(biāo)是表示reads 上從5′到3′端依次堿基的排列。圖3 堿基質(zhì)量分布圖

2.1.2 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控后長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì) 從全部11 021 113條原始序列中去除接頭序列201 318條、含未知堿基N的序列3612條、長(zhǎng)度過(guò)短(<18 nt)的序列4 756 611條、長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)(>32 nt)的序列1 017 128條后，共得到高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果(clean reads)5 042 444條。質(zhì)控之后，對(duì)clean small RNA 的reads 長(zhǎng)度分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，龜甲樣品在18～32 nt中大體呈正態(tài)分布，并在22 nt處出現(xiàn)高峰，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 clean reads 序列長(zhǎng)度分布

2.1.3 已知miRNA鑒定及其表達(dá)分析 對(duì)龜甲樣品中測(cè)得的miRNA進(jìn)行鑒定，共得到578條已知miRNA，部分統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3、4所示。其中xtr-miR-22的count值超過(guò)10 000，其二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖5所示。

2.1.4 新miRNA預(yù)測(cè)及其表達(dá)分析 對(duì)龜甲樣品中測(cè)得的miRNA進(jìn)行鑒定，共預(yù)測(cè)得到120條新miRNA，部分統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5、6。共兩條miRNA的count值超過(guò)10 000，分別命名為NW-006642957-1-500和NW-006622633-1-195，其結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖6所示。

表3 部分已知miRNA的count值統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表4 部分已知miRNA的TPM值統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖5 xtr-miR-22的二級(jí)結(jié)構(gòu)

miRNA名稱(chēng)CountsNW?006642957?1?50019129NW?006622633?1?19510441NW?006615969?1?774606NW?006656176?1?6044543NW?006633404?1?3494538NW?006631183?1?3173736NW?006637514?1?4523088NW?006657619?1?6153071

表6 新預(yù)測(cè)miRNA的部分TPM值統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖6 NW-006622633-1-195和NW-006642957-1-500的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.1.5 靶基因預(yù)測(cè) Count值最高的已知miRNA(xtr-miR-22)的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果如表7所示，在人轉(zhuǎn)錄組中靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果如表8所示，得分最高的是PML基因，為早幼粒細(xì)胞白血病相關(guān)基因。

表7 xtr-mir-22靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

表8 xtr-mir-22靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)選用count值超過(guò)10 000的1條已知miRNA(xtr-miR-22)和2條新預(yù)測(cè)miRNA(NW-006622633-1-195，NW-006642957-1-500)進(jìn)行絕對(duì)定量驗(yàn)證，對(duì)各樣品中3條miRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行計(jì)算，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，結(jié)果如圖7所示。

注：nw-1-195及nw-1-500分別代表2條新預(yù)測(cè)miRNA(NW-006622633-1-195，NW-006642957-1-500)；**表示該miRNA在各樣品中的拷貝數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。圖7 3個(gè)miRNA在各樣品中的拷貝數(shù)計(jì)算結(jié)果

將實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)采用SAS8.2軟件進(jìn)行處理及單因素方差分析，結(jié)果顯示NW-006622633-1-195在龜甲、烏龜動(dòng)物背甲及烏龜同屬動(dòng)物黃喉擬水龜?shù)谋臣字锌截悢?shù)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而NW-006642957-1-500及xtr-mir-22在各樣品中拷貝數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中xtr-miR-22在烏龜背甲中的拷貝數(shù)顯著高于黃喉擬水龜背甲，在龜甲中的拷貝數(shù)顯著高于烏龜背甲。

3 結(jié)論與討論

本研究中采用miRNA轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序?qū)敿字锌赡艽嬖诘膍iRNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，共得到三條count值超過(guò)10 000的miRNA序列：xtr-miR-22，NW-006642957-1-500以及NW-006622633-1-195。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示xtr-miR-22在烏龜背甲中的拷貝數(shù)明顯高于同屬的常用混偽品基原動(dòng)物黃喉擬水龜?shù)谋臣?，且其在龜甲中未發(fā)生明顯的降解，可能為龜甲中具有藥理活性的miRNA。靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示xtr-miR-22可作用于PML基因以抑制其表達(dá)，而PML基因的表達(dá)能夠抑制早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其增殖[25]，因此xtr-miR-22具有潛在的治療早幼粒細(xì)胞白血病的藥理活性。

盡管目前已有很多有關(guān)龜甲藥效及其物質(zhì)基礎(chǔ)的報(bào)道，但由于龜甲本身成分極為復(fù)雜，這些研究多數(shù)停留于提取物及動(dòng)物或細(xì)胞的表觀(guān)變化上，而鮮有觸及作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的報(bào)道。有研究表明，益血生膠囊和補(bǔ)髓生血解毒湯等含龜甲的制劑能夠治療急性白血病化療后的全血細(xì)胞減少癥并降低不良反應(yīng)[26-27]，龜甲在其中主要起到改善骨髓造血機(jī)制、提高機(jī)體免疫力的作用。雖然與本研究在龜甲中發(fā)現(xiàn)的xtr-miR-22的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果并不一致，但考慮到計(jì)算機(jī)靶基因預(yù)測(cè)具有局限性，且miRNA在時(shí)空表達(dá)中往往能夠靶向調(diào)控多個(gè)基因，因此并不能排除miRNAs作為龜甲中具有生物活性的藥效物質(zhì)，筆者后續(xù)將設(shè)計(jì)靶向驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

張辰宇課題組[21]在金銀花miR2911的研究中證實(shí)植物類(lèi)中藥中存在結(jié)構(gòu)極其穩(wěn)定的miRNA，不僅在高溫煎煮中沒(méi)有發(fā)生大量降解，而且能夠通過(guò)胃腸道后由腸上皮細(xì)胞傳遞至其他組織和器官，并通過(guò)靶向調(diào)控基因發(fā)揮其生物活性。對(duì)于人與小鼠等哺乳動(dòng)物，植物miRNA屬于外源miRNA，其結(jié)構(gòu)與動(dòng)物miRNA有一定區(qū)別，尚且能夠跨界調(diào)控動(dòng)物的基因，提示動(dòng)物藥中的miRNA亦具有通過(guò)胃腸道傳遞進(jìn)入人體內(nèi)并調(diào)控人基因的潛力。

本研究以龜甲為例，首次測(cè)序并驗(yàn)證了中藥動(dòng)物藥中存在miRNAs，可能為中藥中一類(lèi)新型的具有藥理作用的活性物質(zhì)，為中藥動(dòng)物藥活性物質(zhì)研究及中藥新藥開(kāi)發(fā)提供了新的思路及理論依據(jù)。

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