王云龍，郭海，魏睦新

(1.南京醫(yī)科大學(xué) 附屬淮安第一醫(yī)院，江蘇 淮安 223001；2.南京醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210003)

肝纖維化是各種感染性或非感染性因素引起的肝臟慢性損傷后導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的病理過(guò)程。肝纖維可進(jìn)展為肝硬化，甚至是肝癌，給家庭、社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，目前尚缺乏有效的治療肝纖維化的藥物[1-3]。隨著對(duì)肝纖維化病理生理機(jī)制研究的深入，越來(lái)越多的研究表明巨噬細(xì)胞參與了肝損傷和纖維化的發(fā)生、發(fā)展，在肝纖維化形成過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，被稱(chēng)為肝纖維化的“中心調(diào)控者”[4-6]。

肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞主要是由肝臟本身的庫(kù)夫細(xì)胞(resident Kupffer cells，KFs)和外周趨化而來(lái)的單核細(xì)胞組成?，F(xiàn)在研究表明在肝臟損傷時(shí)肝臟內(nèi)KFs急劇減少，而外周和骨髓中大量的單核細(xì)胞受單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemoattractant protein，MCP-1)趨化進(jìn)入肝臟，分化為單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞[4]。肝臟損傷時(shí)趨化進(jìn)入肝臟的單核細(xì)胞，可以通過(guò)多種途徑活化肝星狀細(xì)胞，如釋放促纖維化的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor，TGF-β1)[5-6]，導(dǎo)致纖維化的發(fā)生、進(jìn)展。因此減少單核細(xì)胞的趨化被認(rèn)為是治療肝臟纖維化的重要方向之一。

大黃素是大黃、虎杖等常用中藥材中的關(guān)鍵活性成分。而大黃和虎杖則是中醫(yī)藥治療肝纖維化的常用藥物[7]。近年來(lái)對(duì)大黃素研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗炎、抗腫瘤和抗纖維化效果[8]。如展玉濤等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)大黃對(duì)肝纖維化大鼠具有良好的保護(hù)作用，但大黃素抗纖維化機(jī)制仍不清楚。本研究擬在前人研究的基礎(chǔ)上，驗(yàn)證大黃素對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的作用，并從單核細(xì)胞浸潤(rùn)的角度探索可能的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，7～8周齡，體質(zhì)量(24±2)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK2016-0001，小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前置實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)6～8 d，實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度控制在(24±2)℃，相對(duì)濕度為60%～80%，小鼠處理符合江蘇省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理的相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥物及試劑

大黃素(上海源葉生物科技有限公司，純度>90%，HPLC，CAS號(hào)：518-82-1)。四氯化碳(CCl4，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20161011)。橄欖油(四川科龍化工有限公司，批號(hào)：2015060702)。免疫組化一抗抗體CD45(Abcam公司，ab10558)、CD11B(Abcam公司，ab133357)、F4/80(Abcam公司，ab16911)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體(Abcam公司，ab5694)。免疫組化二抗-辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物科技有限公司，PV-6001)。Trizol試劑盒(Invitrogen公司，批號(hào)：15596-019)、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄/熒光試劑盒(TaKaRa公司，批號(hào)：RR420A/RR036A)。

1.3 儀器

applied biosystems QuantStudioTM 6 Flex Real-time PCR儀(美國(guó)Life Technologies)，applied biosystems 2720 Thermal cycler逆轉(zhuǎn)錄儀(美國(guó)Life Technologies)，Allegra X-15R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Benchtop)，BMJ-1型石蠟包埋機(jī)(天津愛(ài)華)，Leica RM-2235型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica)，Bx60型生物顯微鏡(日本Olympus)，T50型勻漿機(jī)(德國(guó)IKA)。

2 方法

2.1 分組及肝纖維化模型制備

肝纖維化模型制備參考Karlmark等[4]制作的小鼠肝纖維化模型。將小鼠隨機(jī)分為3組：空白組、模型組、CCl4+大黃素即大黃素組，每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開(kāi)始造模：大黃素組及模型組按0.6 mL·kg-1的劑量腹腔注射CCl4[CCl4-橄欖油(1∶4)，腹腔注射3 μL·g-1CCl4油劑，每周2次，連續(xù)注射4周，建立肝纖維化小鼠模型]。肝纖維化造模成功判斷依據(jù)：病理可見(jiàn)小鼠肝臟結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成，大量膠原沉淀?？瞻捉M腹腔注射等體積的橄攬油作為對(duì)照。大黃素粉末用0.25%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液混懸，配制成適當(dāng)?shù)臐舛龋簏S素組小鼠每天給予5 μL·g-1大黃素藥液灌胃，大黃素的劑量為40 mg·kg-1·d-1，此劑量參照展玉濤等[9-10]實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為治療肝纖維化最適宜的濃度。每天1次，連續(xù)4周?？瞻捉M和CCl4組給予等體積的0.25% CMC-Na水溶液。

2.2 HE及Masson染色

小鼠麻醉后摘除眼球取血，取小鼠左小葉行中性甲醛固定48 h后，脫水，石蠟包埋，切片厚3 μm，后行HE染色和Masson染色。染色方法參照Huang R等的研究報(bào)道[11]。

2.3 免疫組化

采用免疫組化SABC法檢測(cè)CD45、CD11B、F4/80、a平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)。石蠟切片烘烤后于二甲苯脫蠟，75%乙醇透明，3%過(guò)氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，EDTA高溫抗原修復(fù)，加相應(yīng)濃度的一抗(CD45 1∶2000、CD11B 1∶50000、F4/80 1∶500、α-SMA 1∶2000)孵育過(guò)夜，再加二抗37 ℃ 25 min，最后DAB顯色，中性樹(shù)脂封片。

2.4 Real time PCR方法檢測(cè)小鼠肺組織的TGF-β1和MCP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量

取凍存肝組織4 ℃解凍以后，放入DEPC預(yù)處理的EP管中，在低溫冰塊上將其剪碎，加入1 mL TRozl進(jìn)行組織勻漿。提取總RNA：按RNAiso Reagent試劑盒提取小鼠肝臟組織總RNA，并測(cè)其濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作規(guī)范，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)37 ℃、15 min，85℃反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5 s。PCR反應(yīng)：采用SYBR Premix Ex Taq kit試劑盒相應(yīng)反應(yīng)體系，總體積為20 μL，引物序列如下：MCP-1，上游5′-ATTGGGATCATCTTGCTGGT-3′，下游5′-CCTGCTGTTCACAGTTGCC-3′，引物長(zhǎng)度187 bp；TGF-β1，上游5′-GTGGAAATCAACGGGATCAG-3′，下游5′-ACTTCCAACCCAGGTCCTTC-3′，引物長(zhǎng)度210 bp；β-actin作為內(nèi)參，上游5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，下游5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′，引物長(zhǎng)度205 bp；分別擴(kuò)增MCP-1、TGF-β1和β-actin，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，得到閾循環(huán)值(Ct)平均值，計(jì)算△△Ct值，各個(gè)樣本的mRNA表達(dá)水平均以2-△△Ct表示。

2.5 免疫組化結(jié)果判斷

在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片，Masson染色結(jié)果及α-SMA免疫組化染色結(jié)果在低倍鏡下(×100)進(jìn)行拍照。用Image-ProPlus軟件測(cè)量每個(gè)視野中藍(lán)色(Masson陽(yáng)性)或棕黃色(α-SMA免疫組化陽(yáng)性)區(qū)域的面積(像素)，用每個(gè)視野Masson陽(yáng)性或α-SMA免疫組化陽(yáng)性染色面積(像素)占整個(gè)視野面積(像素)的比例為該切片Masson陽(yáng)性或α-SMA免疫組化陽(yáng)性的比例。每張切片隨機(jī)拍5個(gè)視野，取平均值作為該樣本Masson陽(yáng)性或α-SMA免疫組化陽(yáng)性的比例。對(duì)于CD45、F4/80及CD11b免疫組化結(jié)果則選擇在高倍鏡下(×400)。每只動(dòng)物選取5張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用Image-ProPlus軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野下CD45、F4/80及CD11b陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值作為該樣本CD45、F4/80及CD11b陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)物一般情況

空白組小鼠活潑好動(dòng)，皮毛柔順有光澤，體質(zhì)量無(wú)明顯變化；模型組小鼠活動(dòng)和攝食明顯減少，精神不振，拱背蜷縮，背毛雜亂無(wú)光澤，身體較其他組消瘦；大黃素組大鼠皮毛、飲食與模型組比較有所改善，大便色黃稀軟，小便較黃，體質(zhì)量較模型組減輕。

3.2 肝組織HE染色

如圖1所示，空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞無(wú)壞死，匯管區(qū)未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)清晰；而模型組小鼠的整個(gè)肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，形成許多假小葉，匯管區(qū)見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而經(jīng)大黃素治療后的小鼠肝組織整個(gè)肝區(qū)炎癥較模型組則有明顯改善，肝細(xì)胞壞死及假小葉的形成明顯減少，而整個(gè)匯管區(qū)浸潤(rùn)的白細(xì)胞也較模型組明顯減輕。

3.3 肝組織Masson染色和α-SMA免疫組化

圖2中Masson染色可見(jiàn)空白組小鼠肝臟的肝小葉中央靜脈壁纖維著色，而匯管區(qū)及小葉間隔僅有少量纖維著色。模型組小鼠肝組織內(nèi)的陽(yáng)性染色較空白組明顯增多，從圖2中可以看出已經(jīng)形成肝小葉之間的纖維間隔，以及在中央靜脈和匯管區(qū)周?chē)性S多纖維沉積。大黃素組的小鼠肝臟也存在纖維沉積，而這些纖維沉積的分布與模型組小鼠亦相同，但是其膠原沉積的數(shù)量、分布密度明顯少于模型組。α-SMA是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化標(biāo)志蛋白，當(dāng)HSC被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，即表達(dá)α-SMA。在本實(shí)驗(yàn)中α-SMA陽(yáng)性染色為棕色?？瞻捉M小鼠肝臟組織中除了血管平滑肌有少量表達(dá)α-SMA以外，其余部位幾乎無(wú)表達(dá)(見(jiàn)圖2)。模型組小鼠肝組織的α-SMA表達(dá)明顯增多，沿匯管區(qū)大量分布，呈強(qiáng)陽(yáng)性染色。而大黃素組雖然也能見(jiàn)到許多陽(yáng)性染色，但相比較于模型組，α-SMA陽(yáng)性染色的數(shù)量、密度明顯少于模型組。對(duì)各組Masson染色和α-SMA免疫組化陽(yáng)性比例結(jié)果做統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示模型組小鼠Masson染色和α-SMA免疫組化陽(yáng)性比例明顯高于空白組，而大黃素組Masson染色和α-SMA免疫組化陽(yáng)性比例雖然高于空白組，但也明顯低于模型組(見(jiàn)圖3)?？梢?jiàn)大黃素可明顯改善CCl4所致的小鼠肝纖維化。

圖1 不同組小鼠肝臟HE染色圖

圖2 不同組小鼠肝臟Masson和α-SMA染色圖

注：*P<0.05,**P<0.01；下同。圖3 不同組小鼠肝臟Masson染色(A)和α-SMA免疫組化(B)分析

3.4 CD45、CD11B、F4/80免疫組化

空白組小鼠肝組織中僅有少量的CD45+、CD11B+、F4/80+細(xì)胞浸潤(rùn)，且分布均勻(見(jiàn)圖4)；而模型組小鼠肝組織中見(jiàn)有大量的CD45+、CD11B+、F4/80+細(xì)胞浸潤(rùn)，主要集中在匯管區(qū)周?chē)?。?duì)空白組和模型組CD45+、CD11B+、F4/80+陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；大黃素組小鼠肝臟中亦有CD45+、CD11B+、F4/80+細(xì)胞浸潤(rùn)，但明顯少于模型組。對(duì)大黃素組和模型組的CD45+、CD11B+、F4/80+陽(yáng)性細(xì)胞行進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)圖5。

3.5 小鼠肝組織TGF-β1和MCP-1的RealTime PCR

如圖6所示，在腹腔反復(fù)注射CCl4引起肝纖維化過(guò)程中，小鼠肝臟中TGF-β1表達(dá)明顯上升(P<0.01)，而給予大黃素灌胃的小鼠肝臟中TGF-β1表達(dá)明顯減少(P<0.05)。同時(shí)，從圖6中可以看出，與空白組比較，模型組小鼠肝組織中MCP-1的mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，大黃素組肝組織MCP-1的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，相關(guān)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 不同組小鼠肝臟CD45、CD11B和F4/80免疫組化染色

圖5 不同組小鼠肝臟CD45(A)、CD11B(B)和F4/80(C)免疫組化分析

圖6 不同組小鼠肝臟TGF-β1(A)和MCP-1的mRNA(B)表達(dá)變化

4 討論

肝纖維化是臨床多種肝臟慢性疾病的并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚缺乏有效的治療手段。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在肝纖維化發(fā)生的病理機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[12-13]。巨噬細(xì)胞可分泌腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)等細(xì)胞因子，通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor，NF-κB)促進(jìn)HSC活化[14]；并能合成和分泌大量的促纖維化細(xì)胞因子，如TGF-β1和血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)，TGF-β1和PDGF可直接激活HSC，導(dǎo)致膠原纖維大量合成，引起纖維化[15]。肝臟中巨噬細(xì)胞主要有兩個(gè)方面的來(lái)源，一是肝臟本身的庫(kù)夫細(xì)胞(resident Kupffer cells，KFs)的自我更新；二是炎癥期間趨化進(jìn)入的單核細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，去除肝臟本身的庫(kù)夫細(xì)胞只能部分減輕肝纖維化。而將單核細(xì)胞去除后的小鼠，在進(jìn)行肝纖維化造模過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)肝纖維化較普通小鼠明顯減輕[4]。進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，炎癥期趨化進(jìn)入肝臟的單核細(xì)胞可以分化為單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞，其可釋放促炎和促纖維化的細(xì)胞因子，加重肝損傷和引起肝纖維化。除此之外，近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)一種非典型的單核細(xì)胞，細(xì)胞膜表面分子標(biāo)記為Ceacam1+Msr1+Ly6C-F4/80-Mac1+，在肝纖維化過(guò)程中被招募至肝臟，具有明顯促纖維化作用，但其促纖維化機(jī)制尚不明確[16]。這些研究結(jié)果既提示了單核細(xì)胞在肝纖維化中的關(guān)鍵作用，如何減少單核細(xì)胞浸潤(rùn)可能是治療肝纖維化的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

大黃素是大黃和虎杖等中藥的主要藥物成分，而大黃和虎杖等中藥是中醫(yī)治療肝纖維化的常用藥物?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)大黃素具有抗炎、抗腫瘤和抗纖維化的作用[17-18]，其中大黃素的抗纖維化治療作用已經(jīng)在肺纖維化和肝纖維化上得到證實(shí)[19-20]，但相關(guān)機(jī)制還沒(méi)有完全清楚。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)大黃素有抑制內(nèi)毒素引起的單核細(xì)胞趨化作用[21]。故本研究擬通過(guò)檢測(cè)肝纖維化過(guò)程中單核細(xì)胞浸潤(rùn)的變化來(lái)探索大黃素治療肝纖維化的機(jī)制。

本研究通過(guò)腹腔反復(fù)注射CCl4復(fù)制小鼠肝臟慢性炎癥造成肝纖維化模型，這也是目前比較認(rèn)可的肝纖維化模型。結(jié)果證實(shí)CCl4腹腔反復(fù)注射可以引起小鼠肝臟損傷和肝纖維化，發(fā)現(xiàn)肝纖維化時(shí)肝臟中單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，TGF-β1的合成增多，這與既往認(rèn)識(shí)相符[15]。通過(guò)分析各組小鼠肝臟的HE染色和Masson染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大黃素可以明顯減輕肝臟炎癥和肝臟纖維化。α-SMA是HSC的活化標(biāo)志蛋白，α-SMA的表達(dá)降低說(shuō)明了大黃素減少肝星狀細(xì)胞活化和增殖[22]。CD45、CD11b和F4/80分別是白細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞膜表面特異性的標(biāo)記分子。通過(guò)各組小鼠肝臟中CD45、CD11b和F4/80免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大黃素可以減少CCl4腹腔注射引起的白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在小鼠肝臟中的浸潤(rùn)。這說(shuō)明了大黃素可以減少肝纖維化期間單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞的數(shù)量。

TGF-β1是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)促纖維化細(xì)胞因子，可以直接活化肝星狀細(xì)胞，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，引起肝纖維化[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化形成過(guò)程中，TGF-β1主要是單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞所分泌的[25]。這也是單核細(xì)胞促進(jìn)肝纖維化的重要機(jī)制。本研究也驗(yàn)證了在肝纖維化期TGF-β1表達(dá)升高，而給予大黃素灌胃后，TGF-β1表達(dá)明顯下降。這可能與大黃素減少肝纖維化期單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)。

MCP-1是單核細(xì)胞趨化的關(guān)鍵細(xì)胞因子[26-27]。對(duì)MCP-1-/-小鼠進(jìn)行腹腔反復(fù)注射CCl4制備肝纖維化模型時(shí)，MCP-1-/-小鼠肝臟中單核細(xì)胞浸潤(rùn)減少和肝纖維化程度減輕[26]。藥理性拮抗MCP-1也有相似作用[27]。這些研究證實(shí)了單核細(xì)胞在肝纖維化期的趨化主要通過(guò)MCP-1實(shí)現(xiàn)的。Real time PCR的結(jié)果顯示大黃素可以明顯減少肝臟纖維化期MCP-1的表達(dá)，推測(cè)大黃素是通過(guò)減少M(fèi)CP-1分泌來(lái)抑制單核細(xì)胞浸潤(rùn)。

綜上所述，本研究表明大黃素能夠抑制CCl4導(dǎo)致的肝纖維化，其抗纖維化作用的機(jī)制可能是通過(guò)減少單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞向肝臟浸潤(rùn)，進(jìn)而抑制TGF-β1等促纖維化因子的表達(dá)，減輕肝臟的炎癥反應(yīng)和HSC活化發(fā)揮其抗纖維化的作用。本研究明確了單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞可能是肝纖維化治療靶點(diǎn)，也進(jìn)一步揭示了大黃素抗肝纖維化的部分機(jī)制，為肝損傷和纖維化的治療提供了新的思路。

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