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        祁白術(shù)生物活性物質(zhì)及其抗氧化、抑菌能力研究

        2018-05-02 12:25:57吳永祥江海濤
        食品與機(jī)械 2018年1期
        關(guān)鍵詞:粗提物總酚正己烷

        吳永祥 - 江海濤 - 崔 朋

        方建新1FANG Jian-xin1 王衛(wèi)東3WANG Wei-dong3 胡長玉1HU Chang-yu1

        祁白術(shù)簡稱祁術(shù),為菊科植物白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz·)的干燥根莖,因僅野生分布于安徽祁門及附近地區(qū)而得名。祁白術(shù)在當(dāng)?shù)孛耖g被視為珍貴補(bǔ)品,適宜于久病體虛者和小兒體虛者進(jìn)補(bǔ),藥效持久,補(bǔ)而不膩[1]。李云志等[2-3]采用HPLC-ESI-TOF/MS快速分離鑒別了野生祁白術(shù)的化學(xué)成分,表明野生祁白術(shù)與栽培白術(shù)具有不同的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。祁白術(shù)的道地性及優(yōu)良品質(zhì)可能與當(dāng)?shù)氐刭|(zhì)、氣候、土壤、生物等生態(tài)環(huán)境因素作用有關(guān)[4-5]。白術(shù)含有揮發(fā)油、多糖、黃酮類、內(nèi)酯類化合物、苷類等生物活性成分[6-8],具有抑菌[9]、抗腫瘤[9]、抗炎癥[10]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[11]及改善學(xué)習(xí)記憶、延緩衰老[12]等功效。本課題組前期研究了祁白術(shù)的營養(yǎng)成分及多糖提取工藝,表明祁白術(shù)除可作為藥用外,還能應(yīng)用于功能性食品的開發(fā)[13-14]。目前國內(nèi)外學(xué)者對于白術(shù)化學(xué)成分及功效的研究都是基于栽培白術(shù)[7,9,11-12],對祁白術(shù)不同極性萃取相抗氧化和抑菌作用的研究仍然缺乏,主要活性成分的分析與鑒定尚未見報(bào)道。

        本試驗(yàn)擬對祁白術(shù)醇提物及其不同極性萃取相的總酚、總黃酮含量及抗氧化、抑菌活性進(jìn)行研究,考察總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性,并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析醇提物中的主要化學(xué)成分,旨在闡明道地藥材——祁白術(shù)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),同時(shí)為祁白術(shù)資源在食品、藥品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 材料與試劑

        祁白術(shù):2017年8月于安徽省祁門縣古溪鄉(xiāng)采集,經(jīng)除雜、清洗后,將60 ℃烘干至恒重的祁白術(shù)粉碎成粉末,過80目篩,干燥保存。

        2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、單寧酸(tannic acid, TA)、槲皮素(quercetin, QE)、抗壞血酸(Vitamin C, Vc)、對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben, PP):分析純,美國Sigma-Aldrich公司;

        營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:生物試劑,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;

        所有分離用有機(jī)溶劑:分析純,南京化學(xué)試劑有限公司;

        大腸桿菌(E.coli, G-)、綠膿桿菌(P.aeruginosa, G-)、金黃色葡萄球菌(S.aureus, G+)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis, G+):武漢大學(xué)微生物保藏中心。

        1.1.2 主要儀器設(shè)備

        生化培養(yǎng)箱:SPX-100A型,上海仙象儀器儀表有限公司;

        超凈工作臺(tái):DL-CJ-1N型,北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;

        立式壓力蒸汽滅菌器:LDZF-75KB-III型,上海申安醫(yī)療器械廠;

        全波長酶標(biāo)儀:SpectraMax-190型,美國Molecular Devices公司;

        氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀:Agilent HP7890-5975C型,美國Agilent公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 祁白術(shù)甲醇粗提物及各萃取相的制備 取祁白術(shù)粉末20 g,按照料液比1∶10 (g/mL)與甲醇溶液混合,60 ℃恒溫回流提取3 h,過濾后收集上清液,剩余殘?jiān)侔凑丈鲜鰲l件提取2次,合并3次上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得祁白術(shù)甲醇粗提物5.51 g。將甲醇粗提物混懸于蒸餾水中,按1∶1體積比依次加入正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取,每相萃取3次,分別得到正己烷相0.74 g、二氯甲烷相0.29 g、乙酸乙酯相0.11 g、正丁醇相0.76 g 以及剩余的水相3.47 g。按式(1)計(jì)算祁白術(shù)各萃取相的提取率。

        (1)

        式中:

        R——提取率,%;

        Wf——各萃取相的提取量,g;

        We——甲醇粗提物的提取量,5.51 g。

        1.2.2 總酚含量測定 采用福林酚法[15-16]。以標(biāo)準(zhǔn)品單寧酸濃度C為橫坐標(biāo),吸光值Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.002 2C+0.003 4,R2=0.999。單寧酸在50~250 μg/mL時(shí)與吸光度呈良好線性關(guān)系。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算祁白術(shù)甲醇粗提物及各萃取相中的總酚含量,結(jié)果以每克樣品中含有相當(dāng)單寧酸毫克數(shù)表示,即mg TA/g。

        1.2.3 總黃酮含量測定 采用鋁鹽顯色法[17]。以標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素濃度C為橫坐標(biāo),吸光值Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.025 9C-0.015 7,線性范圍20~100 μg/mL,R2=0.996。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算祁白術(shù)甲醇粗提物及各萃取相中的總黃酮含量,結(jié)果以每克樣品中含有相當(dāng)槲皮素毫克數(shù)表示,即mg QE/g。

        1.2.4 抗氧化活性測定

        (1) 還原能力:參考文獻(xiàn)[18]。以VC為參照,繪制吸光值Y-質(zhì)量濃度C的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得Y= 5.441C+0.200(R2=0.991),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算祁白術(shù)甲醇粗提物及各萃取相的還原能力,計(jì)算結(jié)果以mg VC/g表示。

        (2) ABTS自由基清除能力:參考文獻(xiàn)[19]。以VC為標(biāo)準(zhǔn)品,得到吸光值(Y)與VC質(zhì)量濃度(C)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=798.8C+11.74(R2=0.997),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品對ABTS自由基的清除效果,計(jì)算結(jié)果以mg VC/g表示。

        (3) DPPH自由基清除能力:參考文獻(xiàn)[20~21]。以VC為參照,制作吸光值Y-質(zhì)量濃度C的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得Y=905.7C+6.485(R2=0.990),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品對DPPH自由基的清除效果,計(jì)算結(jié)果以mg VC/g表示。

        1.2.5 抑菌活性測定 將祁白術(shù)甲醇粗提物及各萃取相用二甲基亞砜配置成10.0 mg/mL溶液,將正己烷相配置成1.0,5.0,10.0,15.0,20.0 mg/mL不同濃度的溶液。采用濾紙片擴(kuò)散法測定[22]祁白術(shù)甲醇粗提物及各萃取相對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的抑菌圈直徑。正已烷相最小抑菌濃度的測定參考文獻(xiàn)[23~24]。以二甲基亞砜為空白對照組(CK),以對羥基苯甲酸丙酯為陽性對照組(PP)。

        1.2.6 祁白術(shù)甲醇粗提物化學(xué)成分的GC-MS分析 色譜條件:色譜柱為HP-5MS(5% Phenyl Methyl Silox,30 m×0.25 mm×0.25 μm)的石英毛細(xì)管柱;無分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量為0.5 μL;色譜柱初始溫度為40 ℃(保持3 min),以4 ℃/min升至160 ℃(保持3 min),以6 ℃/min升至285 ℃(保持10 min)。質(zhì)譜條件:離子源為EI源,電子轟擊能量為70 eV,離子源溫度為230 ℃;掃描范圍m/z為35~450 amu全離子掃描。通過與NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫的質(zhì)譜圖作對比,確定待測成分。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        運(yùn)用SPSS 18.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)中的Duncan’s多重比較法分析數(shù)據(jù)間的顯著差異,P<0.05表示差異顯著;采用Pearson’s法分析總酚、總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性。所有試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 總酚、總黃酮含量分析

        由表1可知,祁白術(shù)不同極性萃取相的提取率差異顯著,其中水相、正丁醇相及正己烷相的提取率較高,分別為62.98%,13.79%,13.43%。祁白術(shù)甲醇粗提物及各萃取相均含有總酚和總黃酮等有效成分,其中總酚含量較多(28.77~139.45 mg TA/g),而總黃酮含量較少(2.06~21.28 mg QE/g)。不同溶劑對總酚含量影響的變化趨勢為乙酸乙酯相>二氯甲烷相>正丁醇相>甲醇粗提物>正己烷相>水相,各萃取相均有顯著性差異(P<0.05)。乙酸乙酯相的總酚含量最高,為(139.45±0.19) mg TA/g,其次為二氯甲烷相。乙酸乙酯相從甲醇粗提物中分離的總黃酮高達(dá)(21.28±2.28) mg QE/g,是含量最少的水相[(2.06±0.27) mg QE/g]的10.33倍。

        表1祁白術(shù)不同極性萃取相的提取率及總酚、

        總黃酮含量?

        Table 1 The extraction yields, contents of total phenolics and total flavonoids of different polarity fractions of Qi Baizhu

        樣品提取率/%總酚含量/(mgTA·g-1)總黃酮含量/(mgQE·g-1)甲醇粗提物27.5547.48±1.70d4.87±1.54b正己烷相 13.4344.11±2.67e4.39±0.16b二氯甲烷相5.2698.20±0.22b6.57±1.26b乙酸乙酯相2.00139.45±0.19a21.28±2.28a正丁醇相 13.7968.93±0.74c5.52±0.82b水相 62.9828.77±0.39f2.06±0.27b

        ? 同列不同上標(biāo)字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05)。

        2.2 抗氧化活性分析

        由表2可知,祁白術(shù)甲醇粗提物及不同極性萃取相的還原能力、對ABTS和DPPH自由基清除能力均呈顯著性差異(P<0.05)。乙酸乙酯相、正丁醇相及二氯甲烷相的還原能力較強(qiáng),分別為(38.95±1.66),(14.48±0.58),(14.03±0.03) mg VC/g。ABTS自由基清除能力排序?yàn)橐宜嵋阴ハ?二氯甲烷相>正丁醇相>正己烷相>甲醇相>水相,分別為(302.42±7.51),(249.63±6.37),(118.66±2.86),(75.47±1.44),(72.25±2.45),(21.10±0.07) mg VC/g。各萃取相對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力且差異顯著(P<0.05),其中乙酸乙酯相清除能力最強(qiáng) [(51.61±2.59) mg VC/g],其次為二氯甲烷相。結(jié)果表明,祁白術(shù)各萃取相的還原能力、對ABTS和DPPH自由基清除能力的變化規(guī)律具有較好的一致性,其中乙酸乙酯相的抗氧化活性最強(qiáng)。

        表2 祁白術(shù)不同極性萃取相的抗氧化活性?Table 2 Antioxidant activity of different polarity fractions of Qi Baizhu mg VC/g

        ? 同列不同上標(biāo)字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05)。

        2.3 總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

        由表3可知,還原能力與ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力均呈顯著相關(guān)(P<0.05),相關(guān)系數(shù)R分別為0.875,0.874。ABTS自由基清除能力與DPPH自由基清除能力呈極顯著相關(guān)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)R為0.955。表明3種抗氧化活性檢測方法較好地反映了祁白術(shù)甲醇粗提物及不同極性萃取相的抗氧化作用。

        祁白術(shù)的總酚含量與總黃酮含量之間呈顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)R為0.907。各萃取相的總酚含量與還原能力、ABTS自由基清除能力及DPPH自由基清除能力均呈極顯著相關(guān)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)R分別為0.949,0.982,0.956。總黃酮含量與還原能力、ABTS自由基清除能力及DPPH自由基清除能力均呈顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)R分別為0.967,0.831,0.879。這些結(jié)果表明,總酚、總黃酮是祁白術(shù)中的主要抗氧化活性成分。目前很多研究[25-26]表明,許多植物中的總酚、總黃酮含量與抗氧化能力之間存在良好的相關(guān)性,與本試驗(yàn)結(jié)果相似。

        2.4 抑菌活性分析

        由表4可知,祁白術(shù)的甲醇粗提物、正己烷相、二氯甲烷相及陽性對照(PP)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌均有不同程度的抑制作用;乙酸乙酯相和正丁醇相對大腸桿菌、綠膿桿菌有一定的抑制作用,但對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌無明顯抑制效果;水相則對4種受試菌均無顯著抑制作用。其中正己烷相的抑菌活性最顯著(P<0.05),在10 mg/mL濃度下,對受試菌的抑菌圈直徑分別為大腸桿菌(10.38±0.85) mm,金黃色葡萄球菌(10.13±0.48) mm,枯草芽孢桿菌(9.63±0.25) mm,綠膿桿菌(10.25±0.50) mm。

        本試驗(yàn)進(jìn)一步測定了祁白術(shù)活性部位正己烷相不同濃度條件下對4種受試菌的抑制作用。由表5得知,空白對照組(CK)無抑菌作用,而正己烷相在不同濃度條件下對4種受試菌均具有不同程度的抑制效果,且隨著濃度的增大,抑制作用逐漸增強(qiáng)。正己烷相對4種受試菌的最小抑菌濃度均為1 mg/mL,但在各個(gè)濃度條件下,對大腸桿菌和綠膿桿菌的抑制活性強(qiáng)于同等濃度條件下對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的,表明正己烷相對革蘭氏陰性細(xì)菌的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陽性細(xì)菌。

        2.5 甲醇粗提物化學(xué)成分的GC-MS分析

        對甲醇粗提物化學(xué)成分進(jìn)行了GC-MS定性分析,得到總離子流圖,結(jié)果見圖1。通過與NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫的質(zhì)譜圖作對比,鑒定出18種化合物,占總峰面積量的91.24%,包

        表3 祁白術(shù)的總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析?Table 3 Correlation analysis between total phenolic, flavonoid contents and antioxidant activity of Qi Baizhu

        ? *代表顯著相關(guān)性(P<0.05);**代表極顯著相關(guān)性(P<0.01)。

        表4 祁白術(shù)不同極性萃取物對4種菌的抑菌圈直徑?Table 4 Diameter of inhibitory zone of different polarity fractions of Qi Baizhu against four common bacterial strains mm

        ? 萃取物濃度為10 mg/mL,PP濃度為1 mg/mL;同列不同上標(biāo)字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05)。

        表5 祁白術(shù)正己烷相對4種菌的抑菌圈直徑?Table 5 Diameter of inhibitory zone of hexane fraction from Qi Baizhu against four common bacterial strains mm

        ? 同列不同字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05)。

        括3種酚類(35.02%)、2種醇類(28.63%)、9種烯類(15.42%)、3種酮類(8.99%)、1種酯類(3.18%)化合物。由表6可知,甲醇粗提物的主要化學(xué)成分為3,3'-二氨基-4,4'-二羥基聯(lián)苯(33.47%)、β-桉葉醇(28.33%)、β-愈創(chuàng)木烯(5.91%)、3,3,5,6,7-五甲基-1-茚滿酮(4.70%)、癸二酸二異辛酯(3.18%)、γ-欖香烯(3.11%)等。

        圖1 祁白術(shù)甲醇粗提物的GC-MS總離子流圖Figure 1 Total ion chromatogram of methanol crude extract of Qi Baizhu表6 祁白術(shù)甲醇粗提物的化學(xué)成分及其相對含量

        Table 6 Chemical constituents and relative contents of methanol crude extract of Qi Baizhu

        序號(hào)保留時(shí)間/min化合物相對含量/%127.7484(-)-異丁香烯0.54228.0546γ-欖香烯3.11328.8951α-石竹烯0.22429.8654β-蓽澄茄烯0.56529.9536α-芹子烯0.68630.61782,4-二叔丁基苯酚0.36731.4013(+)-巴倫西亞橘烯1.95834.2861(+)-香橙烯1.31934.6182β-愈創(chuàng)木烯5.911035.2097β-桉葉醇28.331135.33943,3'-二氨基-4,4'-二羥基聯(lián)苯33.471235.5781長葉烯1.141337.2437桉油烯醇0.301437.9286桔利酮1.301542.57243,3,5,6,7-五甲基-1-茚滿酮4.701644.61151',8'-二羥基-3',6'-二甲基-2'-萘乙酮2.991748.30062-(3,7-二甲基-2,6-二辛烯基-4-甲氧基苯酚1.191855.8812癸二酸二異辛酯3.18

        3 結(jié)論

        經(jīng)過試驗(yàn)可知,祁白術(shù)乙酸乙酯相中的總酚、總黃酮含量最高,且表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化活性。相關(guān)性分析表明,總酚、總黃酮含量與還原能力和對ABTS、DPPH自由基清除能力均呈顯著正相關(guān),說明總酚、總黃酮是祁白術(shù)中的主要抗氧化活性成分。體外抑菌試驗(yàn)顯示,正己烷相對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的抑制作用最顯著。經(jīng)GC-MS分析甲醇粗提物中的主要化學(xué)成分,共18種化合物,以酚、醇、烯類化合物為主,其中高含量的酚類、醇類、烯類化合物可能是潛在的抑菌活性成分。本研究闡明了道地藥材祁白術(shù)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為祁白術(shù)資源的綜合開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。下一步將對祁白術(shù)活性部位的分離純化做進(jìn)一步的分析,以明確祁白術(shù)抗氧化和抑菌作用的主要組分。

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