高其宏

(蕪湖市第二人民醫(yī)院胃腸外科，安徽 蕪湖 241000)

大腸癌在臨床上是一種常見(jiàn)的腸道惡性腫瘤，且近年來(lái)發(fā)病率有著逐漸增高的趨勢(shì)。手術(shù)切除和術(shù)后的放、化療及綜合免疫治療等，是大腸癌當(dāng)前最主流的也是最有效的治療方法。對(duì)于早期大腸癌手術(shù)切除后，治療效果明顯，生存期明顯延長(zhǎng)，但對(duì)于中晚期大腸癌術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的概率明顯增加。腫瘤轉(zhuǎn)移的途徑主要有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血運(yùn)轉(zhuǎn)移及局部侵襲、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等[1]。Eph受體酪氨酸激酶A2(erythropoietin-produceing hepatocellular A2，EphA2)是促進(jìn)新生血管形成最主要的因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的促進(jìn)作用[2]。而金屬蛋白酶-2(MMP-2)作為金屬蛋白酶(MMPs)家族重要成員之一，本身是一種明膠酶，它的主要作用就是破腫瘤細(xì)胞周?chē)幕|(zhì)和基膜，從而使腫瘤細(xì)胞能夠更容易的進(jìn)行侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。關(guān)于EphA2和MMP-2在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中到底扮演何種角色，研究的不甚清楚。本文通過(guò)免疫組織化學(xué)法聯(lián)合檢測(cè)EphA2蛋白和MMP-2蛋白在大腸癌及癌旁組織中的表達(dá)，探討其在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1．1 標(biāo)本及分組

(1)大腸癌組織：選取蕪湖市第二人民醫(yī)院2011年1月—2016年12月大腸癌手術(shù)切除后石蠟包埋標(biāo)本76例，其中男性患者44例，女性患者32例，年齡區(qū)間為34～82歲，中位年齡57．6歲。且要求所有患者術(shù)前均未接受對(duì)于腫瘤的針對(duì)性治療。其中高分化(包括高級(jí)別上皮類(lèi)瘤變)癌3例，中分化癌45例，低分化(包括黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌)癌28例。有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51/25例。

(2)癌旁組織：在相應(yīng)的76例大腸癌標(biāo)本中，取距腫瘤3 cm以上病理檢查未受到腫瘤侵犯的大腸組織。

1．2 試劑

MMP-2為鼠抗人單克隆抗體，EphA2為兔抗人多克隆抗體，兩者均購(gòu)自北京中杉金橋生物工程有限公司；枸櫞酸緩沖液及DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物制劑有限公司；雙氧水、微波爐等均來(lái)自本院病理科。

1．3 試驗(yàn)方法

將選中蠟塊按4 mm間距連續(xù)切片，切片常規(guī)進(jìn)行HE染色和免疫組化染色，光鏡下觀察。免疫組織化學(xué)法主要分為幾步：(1)雙氧水行內(nèi)源酶滅活，(2)抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，(3)滴加一抗，(4)滴加二抗，(5)滴加鏈霉素抗生物素過(guò)氧化物酶，(6) DAB顯色，(7)蘇木素復(fù)染，(8)脫水/透明/封片，顯微鏡觀察。

1．4 結(jié)果判斷

EphA2和MMP-2蛋白免疫組化陽(yáng)性表達(dá)均是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色。用半定積分法(即染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞百分率得分之和)判斷兩者表達(dá)強(qiáng)度。染色強(qiáng)度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：胞質(zhì)未著色為0分，著淡黃色為1分，中等黃色為2分，深黃及褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分率的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)高倍鏡視野，通過(guò)計(jì)算每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，得出此切片的平均陽(yáng)性細(xì)胞百分率。平均陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～49%為2分，>49%為3分。兩項(xiàng)得分之和，0～1分為(-)，2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)，2～6分均表示為陽(yáng)性。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS21．0統(tǒng)計(jì)軟件分析包近代數(shù)據(jù)分析。觀測(cè)數(shù)據(jù)主要為計(jì)數(shù)資料，其中部分為等級(jí)數(shù)據(jù)，其它均為兩分類(lèi)數(shù)據(jù)，故組間比較統(tǒng)一采用秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 EphA2和MMP-2在大腸癌、癌旁組織中的表達(dá)情況

大腸癌組織中EphA2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為92.10%(70/76)，顯著高于癌旁組織26．31%(20/76)、(P<0.05)。其中，EphA2中度陽(yáng)性表達(dá)率和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率分別為27.63%(21/76)及25%(19/76)，均顯著高于癌旁組織的表達(dá)率(7.89%)、(5.26%)，見(jiàn)圖1、圖2。MMP-2在大腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為80.20%(61/76)，同樣顯著高于癌旁組織15．90%(12/76)，(P<0.05)；其中大腸癌組織中中度陽(yáng)性表達(dá)率和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率分別為13.16%(10/76)、25%(19/76)，均顯著高于癌旁組織的中度陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率(2.6%，2.6%)，見(jiàn)圖3、圖4。

2．2 EphA2與MMP-2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

大腸癌組織中的EphA2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度較高，且EphA2蛋白表達(dá)水平與大腸癌組織分化程度、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡多有密切關(guān)聯(lián)(部分比較為P<0.05)；MMP-2蛋白在大腸癌組織中同樣呈高表達(dá)，其表達(dá)情況與大腸癌組織學(xué)分化程度、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡也有較密切的關(guān)聯(lián)(部分比較為P<0.05)，見(jiàn)表1、表2。

3 討論

腫瘤組織發(fā)生、發(fā)展有賴(lài)于新生血管的形成為其提供營(yíng)養(yǎng)，EphA2是Eph家族中EphA亞家族的一個(gè)成員，是促進(jìn)新生血管形成最主要的因子之一。有研究顯示EphA2通過(guò)血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)模式，促進(jìn)腫瘤毛細(xì)血管網(wǎng)不斷壯大，從而參與腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程[4]。有研究顯示組織中EphA2表達(dá)程度與毛細(xì)血管的形成呈正相關(guān)，而腫瘤組織只要大于1 mm就會(huì)有毛細(xì)血管形成，因此EphA2在很多實(shí)體腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)。

表1 兩種組織中EphA2和MMP-2的表達(dá)情況及比較/例

表2 大腸癌中EphA2和MMP-2的表達(dá)與各臨床病理特征之間的關(guān)系/例

有觀點(diǎn)認(rèn)為EphA2調(diào)節(jié)血管生成的機(jī)制主要是通過(guò)與其配體EphrinA1的結(jié)合影響腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，并通過(guò)影響細(xì)胞骨架，基質(zhì)黏附和細(xì)胞黏附。從而促進(jìn)組織和內(nèi)皮細(xì)胞形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成、調(diào)控血管生成[5]。由此可見(jiàn)EphA2主要是通過(guò)促進(jìn)腫瘤新生血管形成來(lái)參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。局部浸潤(rùn)及淋巴轉(zhuǎn)移、血性轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要方式，它們直接影響著患者的預(yù)后，而腫瘤新生血管的形成直接參與了上述三大過(guò)程，因此必然是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要一環(huán)[6]。本研究表明，EphA2蛋白在大腸癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織 (P<0.001)，且與大腸癌的Dukes分期明顯相關(guān)(P<0.05)，依此結(jié)果推斷EphA2可能在Dukes分期較晚的腸癌患者中促進(jìn)了大腸癌新生血管的形成，進(jìn)而導(dǎo)致了大腸癌的發(fā)展，并且影響大腸癌出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

MMPs是一個(gè)含有9種酶蛋白分子的家族，它們主要通過(guò)破壞腫瘤組織周?chē)?xì)胞基質(zhì)和基底膜，從而使腫瘤細(xì)胞進(jìn)行更加容易的在局部進(jìn)行浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[7]。細(xì)胞基質(zhì)和基底膜的主要構(gòu)成蛋白則是Ⅳ型膠原和層黏連蛋白，而MMP-2本身是一種明膠酶，它是降解Ⅳ型膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的主要蛋白酶，因此它可能就腫瘤局部浸潤(rùn)的始動(dòng)因素[8]。近年來(lái)不斷有研究顯示MMP-2在一些腫瘤的局部浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用[9]。本研究表明，大腸癌中MMP-2的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P<0．001)。且與大腸癌組織學(xué)分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05)。依此結(jié)果推斷MMP-2可能在組織分化程度不佳的病人中參與了大腸癌的侵襲、浸潤(rùn)，并較早較快的出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致了大腸癌Dukes分期變晚，預(yù)后變差。

EphA2及MMP-2在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中均可能起到了積極地促進(jìn)作用，因此在臨床上我們可以考慮通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)EphA2、 MMP-2表達(dá)水平來(lái)判斷大腸癌的惡性程度，以及預(yù)判患者的預(yù)后情況。另外我們也可以通過(guò)研究EphA2和MMP-2的作用機(jī)制，使它們成為靶向治療的新方向。另外兩者之間是否存在相互促進(jìn)的因素，從而加快了大腸癌的進(jìn)程，它們是否還有其它的作用機(jī)制未被我們發(fā)現(xiàn)，值得我們?nèi)ミM(jìn)一步研究。

(本文圖1～4見(jiàn)插圖5-2)

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