孟 曉,蔣麗施,陳 艷,劉蜀坤

(成都中醫(yī)藥大學公共衛(wèi)生學院,四川成都 611137)

乳酸菌作為公認安全(GRAS)的食品級微生物,具有幾乎無毒副作用、性質(zhì)穩(wěn)定溫和、效果明顯持久的特點,且兼具緩解乳糖不耐癥、治療腹瀉、調(diào)節(jié)宿主的腸道菌群、抑制腸道中促癌酶活性、免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性和有益功能,已成為相關(guān)領(lǐng)域研究人員關(guān)注的熱點[1-3]。值得關(guān)注的,國內(nèi)外研究者觀察到乳酸菌作為一種安全有效的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑,還具有改善氧化應(yīng)激的作用[4-7]。而氧化應(yīng)激已被證實是以高血糖水平為特征的Ⅱ型糖尿病進程中起關(guān)鍵作用的致病因素[8]。

有研究結(jié)果顯示,與模型組相比,低劑量(108CFU/mL)植物乳桿菌NCU116(LactobacillusplantarumNCU116)能夠顯著降低糖尿病(雄性Wistar)大鼠的血糖水平,其血清中過氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)的活性顯著提高,丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量顯著降低[4]。此外,Ejtahed等[5]通過讓高血糖患者食用含有嗜酸乳桿菌La5(LactobacillusacidophilusLa5)和雙歧桿菌Bb12(BifidobacteriumBb12)的酸奶6周,發(fā)現(xiàn)與食用普通酸奶的患者相比,其空腹血糖水平均顯著下降,機體紅細胞中SOD和GSH-Px活性以及總抗氧化能力顯著提高,而血清中MDA含量也顯著低于所有受試對象的平均水平。同樣的,也有研究發(fā)現(xiàn),低劑量(2.0×108CFU/mL)干酪乳桿菌Zhang(LactobacilluscaseiZhang)可以改善高脂膳食動物(雄性Wistar大鼠)的氧化應(yīng)激水平,提高其血清和肝臟中SOD和GSH-Px等抗氧化酶活性,降低MDA水平[6]。上述研究結(jié)果均提示乳酸菌在改善機體氧化應(yīng)激水平方面表現(xiàn)出積極的作用,但目前仍不能明確乳酸菌改善氧化應(yīng)激的功能組分及其作用機制。

在前期研究中已經(jīng)證實來源于發(fā)酵香腸的1株植物乳桿菌(LactobacillusplantarumSCS2,L.plantarumSCS2)能夠顯著降低STZ誘導的高血糖模型小鼠血糖水平,提高其葡萄糖耐受能力;同時,還能夠改善由于高血糖引起的如小鼠體重減輕、血漿中K+丟失,Na+和Cl-含量升高以及肝糖原含量升高等問題[9]。但其發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系尚不清楚。因此,本文以鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)結(jié)合高脂高糖飼料誘導的高血糖模型小鼠為研究對象,L.plantarumSCS2發(fā)酵液上清液、菌體懸浮液和細胞內(nèi)容物懸浮液為受試物,研究灌胃不同受試物對實驗小鼠體重、空腹和餐后2 h血糖、葡萄糖耐受能力、血清中MDA含量和SOD、GSH、GSH-Px活性等指標的影響,并分析L.plantarumSCS2降血糖作用的關(guān)鍵因子及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系,為進一步研究L.plantarumSCS2的降血糖作用機制提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L.plantarumSCS2 分離自四川發(fā)酵香腸,成都中醫(yī)藥大學公共衛(wèi)生學院實驗中心保藏;4周齡SPF級KM雄性小鼠[SCXK(川)2015-030]、基礎(chǔ)飼料和高糖高脂飼料 四川成都達碩實驗動物有限公司;STZ 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;MRS(De Mann,Rogosa and Sharpe)培養(yǎng)基、氯化鈉等 均為分析純,四川成都科龍化工試劑廠;MDA和SOD酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒 上海遠慕生物科技有限公司;GSH和GSH-Px ELISA試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

HH·B11-BS-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器 致微(廈門)儀器有限公司;SW-CJ-2FD型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;血糖儀 勤立生物科技股份有限公司;H2050R-1型高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;YCD-EL200型冰箱 中科美菱低溫科技有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同受試物的制備 取斜面保存L.plantarumSCS2菌株,加入5 mL、0.85%滅菌生理鹽水,振搖混勻制成菌懸液,以1%接種量(V∶V)接種于MRS液體培養(yǎng)基,在36 ℃條件下培養(yǎng)18 h,用0.85%滅菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度為108CFU/mL。將上述發(fā)酵液離心處理5 min(3000×g,5 ℃),收集上清液備用;沉淀菌體用0.85%滅菌生理鹽水制成菌體懸浮液備用。采用上述方法重新獲取相同濃度菌體懸浮液,在冰浴條件下超聲間歇處理(超聲功率400 W,時間間隔5 s)30 min,3000×g,5 ℃ 離心5 min,收集上清液作為細胞內(nèi)容物備用[10-11]。

1.2.2 實驗分組和高血糖模型小鼠的建立 60只4周齡SPF級雄性KM小鼠用完全隨機法分為5組,即普通組(NG)、模型組(MG)、菌懸液組(TG1)、發(fā)酵液上清液組(TG2)和內(nèi)容物組(TG3)。實驗小鼠以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3周后,MG、TG1、TG2和TG3組小鼠禁食不禁水12 h,采用70 mg/kg bw STZ連續(xù)3 d進行腹腔注射,造模期間投喂高脂高糖飼料,持續(xù)1周[12-13]。1周后測定小鼠體重與血糖水平,空腹血糖水平≥7.0 mmol/L,餐后2 h血糖水平≥11.0 mmol/L為造模成功[14-15]。TG1、TG2、TG3組小鼠從第5周開始分別灌胃濃度為108CFU/mL的L.plantarumSCS2菌懸液、發(fā)酵液上清液和細胞內(nèi)容物。NG和MG組小鼠從實驗開始灌胃滅菌生理鹽水,直至第9周實驗結(jié)束。其中,滅菌生理鹽水、菌懸液、發(fā)酵液上清液和細胞內(nèi)容物灌胃量均為10 mL/kg bw[4]。

1.2.3 血糖水平測定 第3周開始至結(jié)束期間每周測定一次空腹與餐后2 h血糖。測定血糖之前小鼠禁食不禁水12 h,采取尾部血液測定其空腹血糖值;投喂食物之后2 h采取小鼠尾部血液,用血糖儀測定其餐后2 h血糖值。

1.2.4 葡萄糖耐受能力測定 小鼠造模成功后第7 d和實驗結(jié)束前(第9周),對各組每只小鼠進行口服葡萄糖耐受量測定。測定前小鼠禁食不禁水12 h,以2 g/kg bw葡萄糖溶液對實驗小鼠進行腹腔注射,測定其0、15、30、60、90、120 min時的血糖水平,繪制葡萄糖耐受量變化曲線[16],計算各組小鼠2 h血糖值的曲線下面積(area under curve,AUC)。

1.2.5 血清中MDA、SOD、GSH和GHS-Px水平測定 實驗結(jié)束后,采用摘眼球取血法采集實驗小鼠血樣,離心10 min(3000×g,4 ℃),取血清,采用ELISA試劑盒和酶標儀檢測實驗小鼠血清中MDA、SOD、GSH和GHS-Px水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件(IBM SPSS公司)進行單因素方差分析(Tukey法),p<0.05表示具有統(tǒng)計學意義。實驗結(jié)果以平均值±標準差形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. plantarum SCS2不同受試物對實驗小鼠體重的影響

由圖1可以看出,除NG小鼠外,MG、TG1、TG2和TG3小鼠在造模成功后(第4周～第5周)體重均呈現(xiàn)下降趨勢。但TG1和TG3小鼠體重在第6周后有所上升,其中TG1小鼠體重上升不顯著(p>0.05),而TG3小鼠體重上升趨勢顯著(p<0.05)。在第9周時TG3小鼠體重已達到(37.2±2.0) g,但MG和TG2小鼠體重則顯著(p<0.05)下降。該結(jié)果表明L.plantarumSCS2細胞內(nèi)容物能夠顯著緩解高血糖模型小鼠體重減輕的病癥。

圖1 實驗小鼠體重變化Fig.1 Change of body weight in mice

2.2 L. plantarum SCS2不同受試物對實驗小鼠血糖水平的影響

從圖2可以看出,除NG組小鼠外,MG、TG1、TG2和TG3小鼠的空腹血糖水平在造模成功后(第4周)均迅速上升,經(jīng)過了2周的不同受試物灌胃后,從第6周開始TG1和TG3小鼠空腹血糖值均有所下降,其中TG1小鼠空腹血糖值下降不顯著(p>0.05),TG3小鼠空腹血糖值下降顯著(p<0.05),當實驗結(jié)束時,TG3小鼠空腹血糖值為(9.2±1.4) mmol/L,而MG和TG2小鼠空腹血糖值則顯著上升(p<0.05)。該結(jié)果表明L.plantarumSCS2細胞內(nèi)容物能夠有效降低高血糖模型小鼠的空腹血糖。

圖2 實驗小鼠空腹血糖水平變化Fig.2 Change of fasting blood glucose in mice

從圖3可以看出,除NG小鼠外,造模成功后,MG、TG1、TG2和TG3小鼠的餐后2 h血糖值均快速上升。經(jīng)過2周灌胃后,從第6周開始,TG3小鼠餐后2 h血糖值顯著下降(p<0.05),實驗結(jié)束時為(11.6±1.1) mmol/L,而TG1和TG2小鼠餐后2 h血糖值無顯著下降(p>0.05)。該結(jié)果表明L.plantarumSCS2細胞內(nèi)容物對高血糖模型小鼠在餐后2 h血糖升高的癥狀有改善作用。

圖3 實驗小鼠餐后2 h血糖水平變化Fig.3 Change of 2 h postprandial blood glucose in mice

2.3 L. plantarum SCS2不同受試物對實驗小鼠口服葡萄糖耐受能力的影響

從圖4A可以看出,經(jīng)過120 min后,除NG小鼠外，其作各組小鼠血糖水平仍未恢復到正常水平。從圖4B也可以看出,MG、TG1、TG2和TG3小鼠的2 h血糖AUC值顯著高于NG小鼠(p<0.05),且上述四組小鼠的2 h血糖AUC值無顯著差異(p>0.05),說明MG、TG1、TG2和TG3小鼠的葡萄糖耐受能力降低。而從圖5A可以看出,經(jīng)過第5周的灌胃實驗后,各組小鼠口服葡萄糖15 min后,其血糖水平均處于最高值,但隨著時間的延長,TG1和TG3小鼠血糖水平開始下降,特別是TG3小鼠血糖水平下降趨勢顯著(p<0.05),當120 min時其血糖值為(8.7±1.3) mmol/L。同樣,從圖5B中可以看出,與MG小鼠相比,TG3小鼠的2 h血糖AUC值有顯著降低趨勢(p<0.05)。該結(jié)果表明L.plantarumSCS2細胞內(nèi)容物能夠改善高血糖模型小鼠的葡萄糖耐受能力。

圖4 造模成功后第7 d實驗小鼠的口服葡萄糖耐受能力及2 h血糖值A(chǔ)UCFig.4 Oral glucose tolerance of mice on the seventh day after modeling and AUC of blood glucose in 2 h注:A為造模成功后第7 d不同受試物對實驗小鼠口服葡萄糖耐受能力的影響,B為造模成功后第7 d不同實驗組小鼠2 h血糖值的AUC;B中不同字母表示各數(shù)據(jù)間有顯著差異(p<0.05)。

圖5 實驗第9周實驗小鼠口服葡萄糖耐受能力及2 h血糖值A(chǔ)UCFig.5 Oral glucose tolerance of mice at the ninth week and AUC of blood glucose in 2 h注:A為實驗第9周不同受試物對實驗小鼠口服葡萄糖耐受能力的影響,B為實驗第9周不同實驗組小鼠2 h血糖值的AUC;B中不同字母表示各數(shù)據(jù)間有顯著差異(p<0.05)。

從上述結(jié)果可以看出,經(jīng)過第5周的灌胃實驗,不同灌胃組實驗小鼠之間在體重、血糖水平和葡萄糖耐受能力等方面均表現(xiàn)出顯著差異。與MG小鼠相比,TG3小鼠的體重、空腹和餐后2 h血糖水平以及葡萄糖耐受能力均有顯著改善(p<0.05),該結(jié)果與前期研究結(jié)果基本相符[9],這可能是由于L.plantarumSCS2自身能夠產(chǎn)生一些具有特定生物活性的物質(zhì),如SOD、GPX、過氧化氫酶、金屬硫蛋白等,有利于其為宿主提供必需氨基酸、維生素,礦物元素等營養(yǎng)物質(zhì),從而控制體內(nèi)葡萄糖代謝過程中相關(guān)產(chǎn)物的分解與合成,使得機體的血糖平衡得以維持[3];TG1小鼠的體重、空腹血糖水平以及葡萄糖耐受能力雖有所改善,但與MG小鼠相比變化不顯著,分析原因可能是由于L.plantarumSCS2菌體經(jīng)過實驗小鼠胃腸道的復雜環(huán)境后定植在腸道黏膜上的數(shù)量較少,不能夠較好地通過維持腸道微生態(tài)平衡的方式,調(diào)節(jié)實驗小鼠的免疫系統(tǒng),改善其機體的免疫潛能從而起到調(diào)節(jié)血糖的作用[1,3];而TG2小鼠各項指標均無顯著改善,可能是由于L.plantarumSCS2發(fā)酵液上清液中所含物質(zhì)不具備調(diào)節(jié)血糖的能力或是L.plantarumSCS2代謝產(chǎn)物含量不足所致。

2.4 L. plantarum SCS2不同受試物對實驗小鼠血清中MDA、SOD、GSH和GSH-Px含量的影響

從圖6可以看出,MG小鼠血清中MDA水平最高,這可能與MG小鼠血糖水平長時間處于較高值有關(guān)。與MG小鼠相比,TG1、TG2和TG3小鼠血清中MDA水平均有所降低。該結(jié)果表明，L.plantarumSCS2細胞內(nèi)容物能夠降低實驗小鼠血清中MDA水平,且該結(jié)果與TG3小鼠血糖水平的降低存在一定聯(lián)系。

圖6 實驗小鼠血清中MDA水平變化Fig.6 Change of MDA levels in serum of mice注:不同字母表示各數(shù)據(jù)間有顯著差異(p<0.05)。

從圖7可以看出,與NG小鼠相比,MG小鼠血清中SOD、GSH和GSH-Px水平均顯著降低(p<0.05)。而與MG小鼠相比,TG3小鼠血清中SOD、GSH和GSH-Px水平均顯著增加(p<0.05),而TG1和TG2小鼠血清中SOD、GSH和GSH-Px水平無顯著變化(p>0.05)。說明L.plantarumSCS2細胞內(nèi)容物可能夠通過降低實驗小鼠血清中MDA水平,提高SOD、GSH和GSH-Px水平的方式改善其機體的氧化應(yīng)激,從而達到降低自身血糖水平的目的。

圖7 實驗小鼠血清中SOD,GSH和GSH-Px水平變化 Fig.7 Change of SOD,GSH and GSH-Px levels in mice注:同一抗氧化酶指標中不同字母表示各組間有顯著差異(p<0.05); GSH和GSH-Px抗氧化酶水平單位為×103 pg/mL。

3 討論

目前,關(guān)于乳酸菌抗氧化和調(diào)節(jié)機體氧化應(yīng)激的機制主要有以下三種假說:

乳酸菌自身具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的抗氧化酶或其形成的代謝產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的功能;乳酸菌或其代謝產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導的方式調(diào)控氧化還原平衡調(diào)節(jié)因子的表達水平從而發(fā)揮對氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用;乳酸菌通過對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用而發(fā)揮對氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用[1]。本文的研究結(jié)果表明,灌胃L.plantarumSCS2細胞內(nèi)容物組小鼠血清中SOD、GSH和GSH-Px等抗氧化酶水平均升高,同時MDA水平降低,而SOD、GSH和GSH-Px恰好是機體Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1-核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件(Keap1-Nrf2/ARE)信號通路調(diào)控的氧化應(yīng)激應(yīng)答系統(tǒng)中幾種重要的抗氧化酶[17-18],這一結(jié)果初步證實了第二種假說,這可能是由于L.plantarumSCS2產(chǎn)生的一些抗氧化劑類的物質(zhì)如SOD、GSH-Px、GSH、阿魏酸等,具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的作用[1]。但在L.plantarumSCS2細胞內(nèi)容物中具體起到調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵因子及其作用機制還需要進一步研究。

4 結(jié)論

L.plantarumSCS2細胞內(nèi)容物能夠降低高血糖模型小鼠的空腹和餐后2 h血糖水平,提高其對于葡萄糖的耐受能力;同時,也能夠顯著提高其血清中SOD、GSH和GSH-Px水平(p<0.05),降低血清中MDA水平的趨勢。這表明L.plantarumSCS2細胞內(nèi)容物中可能含有能夠改善機體氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因子,其可能通過調(diào)節(jié)Nrf2介導的Keap1-Nrf2/ARE信號通路誘導SOD、GSH和GSH-Px等抗氧化酶表達水平上升,從而調(diào)節(jié)機體氧化應(yīng)激水平,且該變化可能與實驗小鼠高血糖水平及其引起的相關(guān)癥狀的改善有一定聯(lián)系,其確切的機制還待進一步研究明確。

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