王鳳軍,葉素丹，*,陳冠武，包永華

(1.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江杭州 310018；2.汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東汕頭 515000)

《2016年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)》報(bào)告顯示轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積最大,為9140萬(wàn)公頃,占全球轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的一半。轉(zhuǎn)入大豆中的基因種類(lèi)較多,大致可分為:改善品質(zhì)、抗蟲(chóng)、抗旱、除草、抗病、高產(chǎn)等幾個(gè)方向[1]。截止2011年,全球共有19個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆獲得批準(zhǔn)商業(yè)化種植,包括1個(gè)抗蟲(chóng)、3個(gè)高油、11個(gè)耐除草劑、1個(gè)抗蟲(chóng)耐除草劑、3個(gè)耐除草劑高油轉(zhuǎn)基因大豆。我國(guó)是大豆和大豆制品進(jìn)口國(guó),國(guó)內(nèi)需求不斷增加。目前為止,被批準(zhǔn)進(jìn)入中國(guó)的轉(zhuǎn)基因大豆品系只有10種(A2704-12、A5547-127、CV127、DP305423、DP305423×GTS40-3-2、DP356043、GTS40-3-2、MON87701、MON87701×MON89788、MON89788)[1]。

轉(zhuǎn)基因生物可以獲得高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品，這可解決人類(lèi)糧食短缺,饑餓,貧窮等生存問(wèn)題,但同時(shí)關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物的安全擔(dān)憂(yōu)也層出不窮[2-5],轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性和合理性爭(zhēng)議一直伴隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展歷程,因此對(duì)作物轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè)也顯得尤為重要。目前轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)主要以PCR方法為主,根據(jù)轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)化時(shí)慣用的啟動(dòng)子如花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(P-35S)、胭脂堿合成酶終止子(T-NOS)以及外源啟動(dòng)子或終止子與作物基因組的交聯(lián)結(jié)構(gòu)基因等設(shè)計(jì)合成特異性引物,用體外擴(kuò)增的方法定性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物樣品[6]。該方法操作簡(jiǎn)便,耗時(shí)短,可以建立針對(duì)某種作物的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)體系,主要有常規(guī)定性PCR法、巢式PCR法,等溫?cái)U(kuò)增法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等[7-10]。如朱琳峰等[11]使用LAMP檢測(cè)方法對(duì)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆Cp4-epsps基因進(jìn)行檢測(cè);付海濱和錢(qián)云開(kāi)等[12-13]使用實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的品系進(jìn)行鑒定。這些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法常常局限于單一基因,檢測(cè)范圍窄,效率低,迫切需要開(kāi)發(fā)高通量快捷性的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法[14-15]。

本研究通過(guò)多重引物和熒光探針組合篩選,反應(yīng)體系優(yōu)化,特異性、重復(fù)性和靈敏性測(cè)試以及樣品適用性驗(yàn)證檢測(cè)等過(guò)程開(kāi)發(fā)建立了二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)技術(shù),該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)靶標(biāo)基因,降低試劑成本,縮短檢測(cè)時(shí)間,提高檢測(cè)效率，為大豆及其深加工產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測(cè)提供了有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10% Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品 深圳安萊爾科技公司;CNAS T025-24/30、CNAS T0659-23/74/79/104/175、ACAS-T067-J213 均為CNAS能力驗(yàn)證樣品;其他用于適用性檢測(cè)的大豆及其深加工制品等樣品 均購(gòu)于市場(chǎng)。

通用型基因組DNA小量制備試劑盒(Koning) 杭州百邁生物股份有限公司;AceTaq?DNA聚合酶(Vazyme)、dNTP mix(10 mM each)、10×PCR Buffer(AceTaq)(Mg2+plus)、PBS 南京諾唯贊生物科技公司;探針與引物 委托美國(guó)Invitrogen公司合成;AB7500熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI公司;NanoDrop 核酸蛋白分析儀 美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 稱(chēng)取干重樣品40 mg或濕重樣品150 mg,按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,加入50 μL滅菌雙重蒸餾水洗脫兩次。提取后取 1 μL 用核酸蛋白分析儀測(cè)定提取的基因組 DNA的濃度和純度,用滅菌雙重蒸餾水將所有樣品標(biāo)定至100 ng/μL,保存于-20 ℃待用。

1.2.2 引物和探針設(shè)計(jì) 在NCBI網(wǎng)頁(yè)檢索轉(zhuǎn)基因大豆常用外源基因P-35S和T-NOS,根據(jù)多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物設(shè)計(jì)與篩選的原則,使用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)多重引物和熒光探針。探針?lè)謩e使用熒光基團(tuán)FAM和Cy5作為發(fā)光基團(tuán),使用BHQ作為非熒光淬滅基團(tuán)。在DNAstar軟件上評(píng)價(jià)引物和探針的特異性,在BLAST網(wǎng)頁(yè)上比對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。檢測(cè)引物和探針使用滅菌雙重蒸餾水稀釋至10 μmol/L備用。

1.2.3 二重?zé)晒釶CR反應(yīng) 20 μL二重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系中包括Taq酶,dNTP,基因組DNA以及2組檢測(cè)引物和探針等成分(具體見(jiàn)表1)。反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃預(yù)變性15 s;95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸1 min,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。定量中設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照、三個(gè)復(fù)孔的重復(fù)實(shí)驗(yàn)和空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照中使用轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的大豆DNA模板,陰性對(duì)照中使用轉(zhuǎn)基因陰性的大豆DNA模板,空白對(duì)照中不加DNA模板,而以滅菌蒸餾水代替,用于檢驗(yàn)是否存在PCR污染和較高的引物二聚體污染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用ABI 7500 software v2.3進(jìn)行分析處理。

表1 二重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)混合液組成Table 1 Reaction mix for mutiplex real-time PCR systems

1.2.4 特異性檢測(cè) 提取ACAS-T067-J213轉(zhuǎn)基因大豆樣本以及CNAS T025-30非轉(zhuǎn)基因大豆樣本基因組DNA,使用上述二重?zé)晒舛縋CR體系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)與判定,驗(yàn)證方法的特異性。

1.2.5 靈敏性檢測(cè) 提取10% Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆樣本基因組DNA,用基因組DNA提取時(shí)所用的洗脫液進(jìn)行梯度稀釋,按照10倍濃度稀釋5個(gè)梯度,分別為23.000、2.300、0.230、0.023、0.0023 ng/μL。根據(jù)大豆的單倍體基因組分子重量約為1.15 pg[16],稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為20000、2000、200、20和2拷貝/μL,對(duì)5個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行二重實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng),每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)重復(fù),驗(yàn)證方法的靈敏性。

1.2.6 適用性檢測(cè) 采用上述大豆轉(zhuǎn)基因成分二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室收集的轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品,以及中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)(CNAS)組織的能力驗(yàn)證樣品等已知樣品進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的大豆及其深加工制品等流通產(chǎn)品,共27個(gè)批次進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)驗(yàn)證方法的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA提取結(jié)果

提取得到的DNA溶液經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測(cè),OD(260 nm/280 nm)大于1.5,OD(260 nm/230 nm)大于1.0,含量為在100 ng/L以上,純度和提取效率較好。使用0.7% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶清晰,完整性好,可用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

圖1 ACAS-T067-J213轉(zhuǎn)基因大豆樣本以及CNAS T025-30非轉(zhuǎn)基因大豆DNA提取結(jié)果Fig.1 The results of DNA isolation from ACAS-T067-J213 transgenic soybean samples and no-transgenic soybean CNAS T025-30注:1:ACAS-T067-J213; 2:CNAS T025-30;M:1ku DNA Ladder。

2.2 引物和探針特異性檢測(cè)

按照1.2.2中的方法針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆常用的P-35S啟動(dòng)子和T-NOS終止子各設(shè)計(jì)2～3對(duì)引物和探針,探針5′ 熒光染料標(biāo)記根據(jù)所采用的實(shí)時(shí)熒光PCR儀的配置和熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜或者吸收光譜而定,探針的3′ 淬滅集團(tuán)為非熒光標(biāo)記,合成后探針進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證,篩選出特異性好的引物和探針用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。篩選的引物和探針信息見(jiàn)表2。

表2 轉(zhuǎn)基因大豆特異性檢測(cè)的引物和探針序列Table 2 The primers and probes of transgenic soya

2.3 特異性檢測(cè)結(jié)果

使用上述的二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆陽(yáng)性樣本和轉(zhuǎn)基因大豆陰性樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè),以驗(yàn)證方法的特異性。結(jié)果表明,在ACAS-T067-J213、CNAS T025-24、CNAS T0659-23、CNAS T0659-79、CNAS T0659-104、CNAS T0659-175等轉(zhuǎn)基因大豆中外源基因P-35S啟動(dòng)子和T-NOS終止子檢出,且擴(kuò)增曲線(xiàn)呈現(xiàn)明顯的S型(其中ACAS-T067-J213轉(zhuǎn)基因大豆的擴(kuò)增曲線(xiàn)見(jiàn)圖2)。CNAS T0659-74、CNAS T025-30等非轉(zhuǎn)基因大豆種子二重?zé)晒釶CR檢測(cè)中P-35S和T-NOS均未檢出,空白對(duì)照均無(wú)信號(hào),檢測(cè)基因之間無(wú)信號(hào)干擾,外源基因的反應(yīng)結(jié)果與期望結(jié)果一致,表明建立的二重實(shí)時(shí)熒光PCR具有較好的特異性。

圖2 ACAS-T067-J213轉(zhuǎn)基因大豆樣本中外源基因P-35S和T-NOS二重?zé)晒釶CR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線(xiàn)圖Fig.2 The amplification plots obtained for simultaneous amplification of P-35S and T-NOS

2.4 靈敏性檢測(cè)結(jié)果

以拷貝數(shù)的自然對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以循環(huán)數(shù)(Ct值)為縱坐標(biāo)做外源基因P-35S和T-NOS的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖3),其中R2分別為0.997和0.996。10% Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆單重和多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)相對(duì)靈敏性分析見(jiàn)表3,可見(jiàn)本研究建立的二重實(shí)時(shí)熒光PCR與單重實(shí)時(shí)熒光PCR的穩(wěn)定性和靈敏性相當(dāng)。在二重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)中,檢測(cè)同一參照樣品重復(fù)間Ct值變異較小,外源基因P-35S的Ct值變化范圍在19.23～34.09之間,標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.202～0.789之間,擴(kuò)增效率為93%;外源基因T-NOS的Ct值變化范圍在22.73～35.69之間,標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.397～0.910之間,擴(kuò)增效率為91%,最低檢測(cè)限為2拷貝/μL,表明本研究建立的二重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法靈敏性較高,能夠滿(mǎn)足篩選檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆及其制品中轉(zhuǎn)基因成分的需要。

表3 10% Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆單重和多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)相對(duì)靈敏性分析Table 3 The relative sensitivity analyses of single and multiplex qPCR systems used in detention of 10% Roundup Ready transgenic soya reference materials

圖3 10% Roundup Ready transgenic soybean樣品中P-35S和T-NOS基因二重?zé)晒釶CR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖Fig.3 Standard curves of detected genes of P-35S and T-NOS from 10% Roundup Ready transgenic soybean in duplex qPCR assay

2.5 適用性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)采自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的2批大豆和豆腐、腐竹、老豆干、素雞、腐乳、素肉串、豆奶、豆?jié){、豆腐腦、豆瓣醬、豆卷、板筋等12種大豆制品25個(gè)批次樣品,以及實(shí)驗(yàn)室保存的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品和能力驗(yàn)證剩余樣品進(jìn)行二重實(shí)時(shí)熒光PCR和內(nèi)源基因Letin的檢測(cè),其中Letin基因均被檢出,保證了核酸提取的有效性,不會(huì)出現(xiàn)假陰性檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)按照使用較多的標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1204-2003[17]和GB/T 19495.5-2004[18]中規(guī)定的單重實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)外源基因P-35S和T-NOS進(jìn)行篩選檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用建立的二重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,2個(gè)批次的大豆樣本中P-35S和T-NOS兩個(gè)靶標(biāo)基因均未檢出,而在其25個(gè)批次的大豆制品中只有2個(gè)腐竹樣本檢出了兩個(gè)靶標(biāo)基因(見(jiàn)表4),檢出率為7.4%,與標(biāo)準(zhǔn)中的方法檢測(cè)結(jié)果一致,采自于市場(chǎng)的27個(gè)批次的樣本和實(shí)驗(yàn)室保存的9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品以及能力驗(yàn)證剩余樣品均未出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果,表明建立的二重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法具有很好的適用性。

表4 農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)大豆及其制品抽樣檢驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果匯總表Table 4 The summary table of the transgenic positive results of in the soybeans and their products from the farmers markets

3 結(jié)論

本研究建立的二重?zé)晒釶CR技術(shù)可同時(shí)對(duì)P-35S,T-NOS兩個(gè)外源基因進(jìn)行檢測(cè),為保證方法的準(zhǔn)確性,通過(guò)了特異性、重復(fù)性和靈敏性的驗(yàn)證,確保了該方法在同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)靶標(biāo)基因時(shí),無(wú)熒光信號(hào)的相互干擾,不會(huì)出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果;通過(guò)對(duì)比優(yōu)化實(shí)驗(yàn),摸索出二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)的最佳反應(yīng)體系,擴(kuò)增效率在90%～110%之間;通過(guò)梯度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)決定系數(shù)R2大于0.98,確定了最低檢測(cè)限為2拷貝/μL。通過(guò)對(duì)27個(gè)批次的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分篩選測(cè)試,結(jié)果與預(yù)期的一致,顯示該方法有較好的適用性。開(kāi)發(fā)和建立的二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)技術(shù)可為大豆及其深加工產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分的快速篩選檢測(cè)提供了有效方法,可用于口岸和市場(chǎng)流通大豆樣品的篩選檢測(cè)。

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