朱芳娟，侯靈莉，孫黔云，楊慶雄

(1.貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001；2.貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014；3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550014；4.貴州師范大學(xué)喀斯特研究院/國家喀斯特石漠化防治工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550001)

葉下珠(Phyllanthusurinaria)又名陰陽草、油甘草、珍珠草等，為大戟科(Euphorbiaceae)葉下珠屬一年生草本植物，廣泛分布于全世界熱帶及亞熱帶地區(qū)如泰國、菲律賓、非洲等地，在我國主要分布于長江以南地區(qū)[1]。葉下珠屬植物的化學(xué)成分復(fù)雜，含有木脂素、多酚等多種類型的化合物。葉下珠及同屬的多種植物，作為傳統(tǒng)中藥以干燥全草入藥，具有平肝清熱、利水解毒的功效，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌、抗骨質(zhì)疏松、抗菌、抗血栓等作用[2-3]。我們前期篩選發(fā)現(xiàn)葉下珠粗提物具有抗補體活性，鑒于補體與諸多疾病有密切關(guān)系，本文以活性為向?qū)ч_展了葉下珠抗補體活性的研究。

1 材料

1.1藥物與試劑葉下珠全草采集于廣西東部地區(qū)，由貴州師范大學(xué)喀斯特研究院楊慶雄教授鑒定為大戟科葉下珠屬葉下珠(Phyllanthusurinaria)。樣品標(biāo)本保存于貴州師范大學(xué)喀斯特研究院。綿羊紅細(xì)胞、兔紅細(xì)胞、大鼠血清(貴州省實驗動物中心)；標(biāo)準(zhǔn)人血漿(德國Siemens)；色譜乙腈(德國 Merck)；石油醚、乙酸乙酯、氯仿均為分析純；提取用甲醇為工業(yè)級；葡聚糖凝膠Sepharmadex LH-20(安瑪西亞技術(shù)有限公司)。

1.2儀器Revco超低溫冰箱(美國 Thermo)；5810R冷凍離心機(jī)(德國 Eppendorf)；Molecular Devices Spectra MAX-190連續(xù)波長酶標(biāo)儀(美國MD)； N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海埃朗)；T-214 電子天平(北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司)；Elix 純水系統(tǒng)和 Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore)；Shimadazu LC-15C高效液相色譜儀(日本島津)。

2 方法

2.1葉下珠抗補體活性成分的分離鑒定葉下珠原料9.0 kg，粉碎后，甲醇冷浸提取3次，每次浸泡 24 h，合并 3 次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸餾除去溶劑，得到甲醇浸膏。甲醇浸膏先后使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取分段，每種溶劑均萃取3次。分別合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下減壓蒸餾濃縮，除去溶劑，分別得到石油醚部分95.0 g、氯仿部位38.5 g、乙酸乙酯部分79.6 g、水部分125.5 g。

葉下珠各個分段提取物進(jìn)行抗補體溶血活性測定，選擇抗補體活性效果明顯的部分進(jìn)一步分離純化。葉下珠乙酸乙酯部位，經(jīng)MCI柱分離得4部分(Fr.1～4)。經(jīng)活性測定后，F(xiàn)r.3為活性部位，對這個部位進(jìn)行進(jìn)一步的分離。Fr.3(1.6 g)上葡聚糖凝膠柱Sephadex LH20，甲醇 ∶水(20%、40%、60%、80%、100%)梯度洗脫，從60%部位中分離得化合物1(292.4 mg)，80%部位上制備HPLC，30%乙腈水溶液洗脫，得到化合物2(5.4 mg)。

2.2抗補體經(jīng)典途徑的測定致敏綿羊紅細(xì)胞懸液的制備方法[4]：將保存在阿氏液中的綿羊紅細(xì)胞(sheep red blood cell，SRBC)用GGVB++緩沖溶液洗滌，2 500 r·min-1離心10 min，重復(fù)洗滌3次，再用GGVB++緩沖溶液配成濃度為1.0×1012·L-1的SRBC懸液，取等體積效價為1 ∶1 500的溶血素加入SRBC懸液中，混勻后，置于37℃水浴孵育30 min，存放于4℃冰箱備用。

人血漿稀釋度的確定參照文獻(xiàn)[4]的方法。不同稀釋度的人血漿(用GGVB++緩沖溶液稀釋)、致敏綿羊紅細(xì)胞各100 μL加入試管中，37℃水浴孵育，每隔5 min輕搖1次，30 min后加入1 mL冷生理鹽水終止反應(yīng)，2 500 r·min-1離心10 min，取200 μL上清液，采用酶標(biāo)儀測定412 nm吸光值，選取溶血率在70%～80%之間的稀釋度進(jìn)行實驗。

抗補體溶血活性測定參照文獻(xiàn)[4]的方法。樣品用二甲基亞砜溶液配制成濃度為10 g·L-1的儲備液，使用前用PBS稀釋。將不同濃度的樣品、稀釋人血漿(用GGVB++按1 ∶20稀釋)、致敏綿羊紅細(xì)胞 (5.0×1011·L-1) 各100 μL加入試管中，輕輕混勻，37℃水浴孵育 30 min，每5 min輕搖1次，孵育結(jié)束后，立即加入 1 mL冷生理鹽水終止反應(yīng)，于2 000 r·min-1離心 10 min，取上清液在波長 412 nm 處測定吸光度值。根據(jù)下列公式計算各組的溶血率和抑制率。

溶血率=[(A正常管/樣品管-A血清管-A血球管)/

(A全溶管-A血球管)]×100%

抑制率=[1-樣品組溶血率/正常組溶血率 ]×100%

2.3抗補體旁路途徑的測定取保存在阿氏液中的兔紅細(xì)胞，用GVB-Mg-EGTA緩沖溶液洗滌， 2 000 r·min-1離心10 min，反復(fù)3次，再用GVB-Mg-EGTA緩沖溶液配成濃度為1.5×1011·L-1的懸液備用。

參照文獻(xiàn)方法[5]，用 PBS稀釋樣品，取5 μL加至95 μL GVB-Mg-EGTA緩沖溶液(含2 mmol·L-1MgCl2、8 mmol·L-1EGTA)中，加入100 μL大鼠血清(含4 mmol·L-1MgCl2、16 mmol·L-1EGTA緩沖溶液1 ∶5稀釋)，再加入100 μL兔紅細(xì)胞懸液，充分均勻后，于37 ℃水浴30 min，每隔5 min輕搖1次。之后加入0.5 mL冷生理鹽水終止反應(yīng)，2 000 r·min-1離心，取200 μL上清液于412 nm測吸光度。

2.4樣品對經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶形成的影響不同濃度的樣品液、人血漿(用GGVB++按1 ∶20稀釋)各100 μL加入試管中，37℃恒溫水浴孵育10 min，再加入致敏綿羊紅細(xì)胞100 μL，37℃恒溫水浴孵育5 min，然后加入生理鹽水1 mL，2 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)洗紅細(xì)胞2次，棄上清，加入100 μL稀釋血漿(用含40 mmol·L-1EDTA的GVB緩沖溶液稀釋)，37℃恒溫水浴孵育30 min，加入0.9 mL冷生理鹽水終止反應(yīng)。2 000 r·min-1離心10 min，取上清液，在波長412 nm處測吸光度。

3 結(jié)果

3.1葉下珠的活性成分的分離鑒定葉下珠甲醇提取物以及各極性部分抗補體活性篩選結(jié)果顯示，葉下珠總提取物和乙酸乙酯萃取部位抗補體效果好(Fig 1)。根據(jù)結(jié)果，對乙酸乙酯部位進(jìn)行分離，獲得兩個有活性的化合物1和2。

Fig 1 The anticomplementary activity of various extracts

1:Methanol extract;2:Water extract;3:Petroleum ether extract;4:Chloroform extract;5:Ethyl acetate extract.

化合物1： 灰白色粉末。13C-NMR (400 MHz,CD3OD) ∶δ ∶61.4 (C-6),63.5 (C-4),68.1 (C-2),69.8 (C-3),74.7 (C-5),93.3 (C-1),107.2(C-2?),109.0 (C-2?),109.9 (C-2′，6′),114.9 (C-6?),115.6 (C-6″),119.9 (C-1′),124.6 (C-1?),124.8 (C-1″),135.8 (C-4?),136.3 (C-4″),138.4 (C-4′),143.9 (C-3″),144.0 (C-5?),144.5(C-5″),145.0 (C-3′，5′),145.3 (C-3?),164.3 (C-7′),166.3 (C-7″),167.7 (C-7″)。與文獻(xiàn)[6]報道的柯里拉京結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)基本一致，所以推定化合物1為柯里拉京(corilagin)。

化合物2：淺黃色粉末。13C-NMR(400 MHz,CD3OD) ∶δ ∶107.8 (C-1,1′),140.6 (C2-2′),135.9 (C-3,3′),147.9 (C-4,4′),110.8 (C-5,5′),111.9(C-6,6′),158.6(C-7,7′)，與文獻(xiàn)[7]中對比基本一致，由此鑒定化合物2為鞣花酸(ellagic acid)。

3.2抗補體經(jīng)典途徑活性抗補體經(jīng)典途徑溶血實驗表明，乙酸乙酯萃取部位、化合物1和2均能夠抑制補體活性，其IC50分別為53.77、176.54、102.23 mg·L-1(Fig 2、3)。

Fig 2 Effect of samples on hemolytic activity of complement classical pathway

Fig 3 The inhibitory effect of samples on hemolytic activity of complement classical pathway

3.3抗補體旁路途徑活性對補體旁路途徑測定表明，葉下珠提取物對其抑制效果不明顯(Fig 4、5)。

3.4樣品對經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶形成的影響對補體經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶的抑制實驗中，乙酸乙酯萃取物、柯里拉京、鞣花酸均表現(xiàn)出抑制作用，其中乙酸乙酯萃取部位的抑制作用最好(Fig 6)。

Fig 4 Effect of samples on hemolytic activity of complement alternative pathway

Fig 5 The inhibitory effect of samples on hemolytic activity of complement alternative pathway

Fig 6 Effect of samples on formation of C3 convertase of complement classical pathway

4 討論

補體在天然免疫系統(tǒng)中具有重要的作用，其激活有經(jīng)典、旁路和凝集素3條途徑。補體過度激活會導(dǎo)致人體自身正常組織的炎癥和損傷[8]，在諸多病癥的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要角色，如急性肺損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、缺血/再灌損傷等。抑制補體已成為防治補體相關(guān)疾病和損傷的重要策略之一[9]。目前，從天然產(chǎn)物中已分離出多種類型的抗補體活性成分，包括多糖、黃酮、甾體、皂苷、生物堿等[10]。天然產(chǎn)物將會是抗補體新藥的重要來源。

葉下珠提取物已報道的活性有抗氧化、抗輻射、抗腫瘤和抗病毒等[11]，目前尚未見葉下珠抗補體活性的研究報道。我們前期篩選發(fā)現(xiàn)葉下珠提取物具有抗補體活性。本研究顯示，葉下珠的乙酸乙酯萃取物具有明顯的抗補體活性，再對其進(jìn)行提取分離，得到兩個活性化合物柯里拉京和鞣花酸。實驗結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取物、鞣花酸、柯里拉京的抗補體經(jīng)典途徑溶血活性的IC50分別為53.77、102.23、176.54 mg·L-1，但對旁路途徑無明顯作用，表明葉下珠成分主要影響經(jīng)典途徑。在病理生理條件下，補體激活的經(jīng)典途徑開始于C1q與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合后，依次活化C1r、C1s、C4、C2，形成經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2b)，啟動補體活化的級聯(lián)反應(yīng)。而補體旁路途徑則是由微生物或其他病原激活，在旁路途徑成分B因子、D因子等參與下，形成C3轉(zhuǎn)化酶[12]，從而引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)?；谌~下珠樣品對經(jīng)典途徑溶血活性的影響，我們進(jìn)一步研究了樣品對經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶形成的影響。結(jié)果表明，葉下珠抗補體活性成分影響了經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶的形成。通過對乙酸乙酯萃取部位、化合物1和2的抗補體活性的比較，提示了葉下珠中可能還存在活性更高的化合物。本工作有助于加深對葉下珠藥用功效及物質(zhì)基礎(chǔ)的認(rèn)識，也為進(jìn)一步研究葉下珠活性成分提供了實驗依據(jù)。

(致謝：本研究化學(xué)部分是在貴州師范大學(xué)楊慶雄教授課題組完成，抗補體活性部分在貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室孫黔云研究員課題組完成，特此表示感謝。)

參考文獻(xiàn)：

[1] 鄭秀青.葉下珠化學(xué)成分分離和藥理作用的研究 [D].福州：福建農(nóng)林大學(xué),2008.

[1] Zheng X Q.Study on chemical composition separation and pharmacological action ofPhyallanthusurinariaL[D].Fuzhou：Fujian Agriculture and Forestry University,2008.

[2] Tong F,Zhang J,Liu L, et al.Corilagin attenuates radiation-induced brain injury in mice[J].MolNeurobiol,2016,53(10):6982-96.

[3] Patel J R,Tripathi P,Sharma V,et al.Phyllanthus amarus:ethnomedicinal uses,phytochemistry and pharmacology:a review[J].JEthnopharmacol,2011,138(2):286-313.

[4] 沈良賢.脂多糖激活補體對內(nèi)皮細(xì)胞的作用及抑制補體對脂多糖致急性肺損傷的影響 [D].遵義：遵義醫(yī)學(xué)院, 2011.

[4] Shen L X.Effect of lipopolysaccharide-activated complement on endothelial cell and the effect of complement inhibition on lipopolysaccharide-induced acute lung injury[D].Zunyi:Zunyi Medical College,2011.

[5] 孫黔云,葉巧玲,閆銀萍.小鼠血清補體替代途徑溶血活性測定的新方法[J].中國藥理學(xué)通報,2011,27(11):1619-22.

[5] Sun Q Y,Ye Q L,Yan Y P.A new method for measurement of the alternative pathway activity of mouse serum complement[J].ChinPharmacolBull,2011,27(11):1619-22.

[6] 沙東旭,劉英華,王龍順,徐綏緒.葉下珠化學(xué)成分的研究[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2000,17(3):176-8.

[6] Sha D X,Liu Y H,Wang L S, Xu S X.Studies on the chemical constituents of common Leafflower (Phyllanthusurinaria)[J].JShenyangPharmUniv,2000,17(3):176-8.

[7] 黃永林，李典鵬，楊子明．紅背山麻桿葉的化學(xué)成分研究(Ⅳ)——多酚類化合物[J].廣西植物, 2015,35(4):564-8.

[7] Huang Y L, Li D P, Yang Z M.Chemical constituents from the leaves ofAlchorneatrewioides(4).Polyphenols[J].Guihaia, 2015,35(4):564-8.

[8] 周 英,李 敏,孫黔云.綠原酸、咖啡酸和阿魏酸對補體旁路激活致內(nèi)皮細(xì)胞炎癥相關(guān)分子表達(dá)的干預(yù)[J].中國藥理學(xué)通報,2016,32(12):1723-8.

[8] Zhou Y,Li M,Sun Q Y.Effect of chlorogenic acid,caffeic acid,and ferulic acid on inhibition of inflammatory response of HMECs induced by activated complement alternative pathway[J].ChinPharmacolBull,2016,32(12):1723-8.

[9] 郭 靜,李 敏,楊付梅,孫黔云.補體旁路激活致小鼠急性肺損傷的炎癥病理機(jī)制研究[J].中國藥理學(xué)通報,2016,32(11):1521-6.

[9] Guo J,Li M,Yang F M,Sun Q Y.Inflammatory mechanism of acute lung injury in mice induced by activation of complement alternative pathway[J].ChinPharmacolBull,2016,32(11):1521-6.

[10] Arumugam T V,Woodruf T M,Lathia J D,et a1.Neuroprotection in stroke by complement inhibition and immunoglobulin therapy[J].Neuroscience,2009,158(3):1074-89.

[11] Tong G D,Zhang X,Zhou D Q,et al.Efficacy of early treatment on 52 patients with preneoplastic hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma by compoundPhyllanthusUrinariaL[J].ChinJIntegrMed,2014,20(4):263-71.

[12] 孫黔云.眼鏡蛇毒因子在生命科學(xué)中的應(yīng)用[J].生命科學(xué),2016,28(1):22-6.

[12] Sun Q Y.Application of cobra venom factor in life sciences[J].ChinBullLifeSci,2016,28(1):22-6.