張 嫻，李園園，李雪江，張 燕，胡廷華，馬俊彥

昆明地區(qū)漢族人群FAS/FASL基因多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性分析

張 嫻1，李園園1，李雪江1，張 燕1，胡廷華2，馬俊彥2

目的探討Fas-1377G>A和FasL-844C>T基因多態(tài)性與昆明地區(qū)糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)的相關(guān)性。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)技術(shù)對(duì)31例DR患者(病例組)和23例糖耐量正常的對(duì)照者(對(duì)照組)進(jìn)行FAS-1377、FASL-844兩個(gè)基因多態(tài)性檢測(cè)基因型及等位基因頻數(shù)分布。結(jié)果fas-1377位點(diǎn)3種基因型AA、AG和GG在對(duì)照組研究對(duì)象中的頻數(shù)分別為9.7%、54.8%和35.5%，在病例組的頻數(shù)分別為13%、52.2%和34.8%，基因型頻數(shù)分布組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(fisher=0.282,P=1.0)；等位基因A和G在對(duì)照組中的頻數(shù)分別為37.1%和62.9%，在病例組的頻數(shù)分別為39.1%和60.9%，等位基因型頻數(shù)分布組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.046,P=0.829)。fasL-844位點(diǎn)3種基因型CC、CT和TT在對(duì)照組研究對(duì)象中的頻數(shù)分別為41.9%、45.2%和12.9%，在病例組的頻數(shù)分別為60.9%、34.8%和4.3%，基因型頻數(shù)分布組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(fisher=2.178,P=0.334)；等位基因C和T在對(duì)照組中的頻數(shù)分別為64.5%和35.5%，在病例組的頻數(shù)分別為78.3%和21.7%，等位基因型頻數(shù)分布組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.393,P=0.122)。用logistic回歸分析4種模型， FasL-844基因攜帶T者患病例組風(fēng)險(xiǎn)可能升高，TC,TT,TC+TT,TOR值分別為1.885，4.308，2.154，1.980(P>0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)攜帶FAS-1377GG和FASL-844 CT/TT基因型的風(fēng)險(xiǎn)較同時(shí)攜帶FAS-1377GG和FASL-844CC基因型增加患DR發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.143(95%CI=0.141-9.289)；OR=0.343(95%CI=0.052-2.261)；OR=2.286(95%CI=0.185-28.186)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論Fas-1377、FasL-844基因多態(tài)性位點(diǎn)可能與昆明漢族DR易感性無相關(guān)性，可能不是該地區(qū)DR的常見遺傳易感因素。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；Fas-1377；FasL-844；基因多態(tài)性

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是最常見造成視力減退或失明的眼病，流行病學(xué)研究表明，5年以上的糖尿病患者約51.3%發(fā)生視網(wǎng)膜病變[1]，嚴(yán)重者可導(dǎo)致失明，其致病性尚未完全闡明，目前認(rèn)為多種因素，包括遺傳、環(huán)境因素及其相互作用與該病的發(fā)生密切相關(guān)，隨著DR遺傳學(xué)研究的發(fā)展，基因多態(tài)性與DR的關(guān)系倍受關(guān)注?，F(xiàn)有報(bào)道DR有關(guān)的染色體突變位點(diǎn)已達(dá)20余個(gè)，其中FAS-1377G>A/FASL-844C>T基因多態(tài)性與DR的關(guān)系己在白種人中得到證實(shí)[2]，但在不同國家及地區(qū)人群中患病率是否存在差異尚未報(bào)道。筆者通過PCR-RFLP，并結(jié)合DNA測(cè)序來探討該基因組多態(tài)性在中國云南昆明地區(qū)2型糖尿病視網(wǎng)膜病變?nèi)巳褐械南嚓P(guān)性，為今后FAS/FASL基因多態(tài)性在2型糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的病因研究及群體篩查奠定基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇2012-11至2015-12在武警云南總隊(duì)醫(yī)院就診的2型糖尿病患者82例，經(jīng)眼底鏡和(或)眼底熒光造影檢查確診DR者病例組31例(DR組)，其中男17例，女14例，年齡(57.89±13.42)歲，糖尿病病程8.5～36 (23.11±3.3)年；在我院體檢的正常對(duì)照組(NC組)23例，男11例，女12例，年齡(55.63±4.17)歲。檢測(cè)者均來自云南省昆明地區(qū)居住的漢族人群，記錄2組的性別、年齡、身高、體重均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 DNA提取 取外周靜脈血5ml，蛋白酶K處理后苯酚氯仿法提取基因組DNA。

1.2.2 DNA引物 見表1。

表1 FAS/FASL DNA 引物序列

1.2.3 PCR反應(yīng)體系(20 μl體系)及反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)體系為20 μl，包括10×Buffer(Mg2+Plus)2 μl，Taq酶(5 U/μl)及dNTP(10 mM)各0.2 μl，上下游引物各0.4 μl ( 20 pmol /μl) ，DNA模板1 μl ( 50～300 ng /μl) ，不足部分由雙蒸水補(bǔ)充。FAS-1377位點(diǎn)PCR擴(kuò)增參數(shù): 預(yù)變性95 ℃，5 min，變性94 ℃，30 s，退火FAS63 ℃，F(xiàn)ASL68 ℃,30 s，延伸72 ℃，30 s，變性、退火、延伸40個(gè)循環(huán)后，再次延伸72 ℃，7 min。FASL-844位點(diǎn)PCR擴(kuò)增參數(shù): 預(yù)變性95 ℃，5 min，變性94 ℃，30 s，退火68 ℃，30 s，延伸72 ℃，30 s，變性、退火、延伸40個(gè)循環(huán)后，最后72 ℃延伸7 min。

1.2.4 酶切反應(yīng)體系 取5 μl PCR產(chǎn)物加0.5 μl限制性內(nèi)切酶Apal(Fermentas公司)雙蒸水補(bǔ)足至10μl，恒溫箱37 ℃水浴過夜。

1.2.5 DNA測(cè)序 酶切產(chǎn)物在4%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化，純化產(chǎn)物雙向測(cè)序，采用測(cè)序儀器3730XL (BigDye Version3.1,Applied Biosystems)，用Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行DNA測(cè)序，觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用spss16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，兩組間比較采用t檢驗(yàn)及協(xié)方差分析；應(yīng)用fisher確切概率法進(jìn)行基因型分布的Hardy-Weinberg平衡性檢驗(yàn)，病例組與對(duì)照組間基因型與等位基因型分析的Fisher檢驗(yàn)、logistic回歸分析，并對(duì)成組資料進(jìn)行相關(guān)分析；對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和非條件logical回歸分析FAS/FASL基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性。以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DNA測(cè)序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物FAS長(zhǎng)度為284 bp FASL長(zhǎng)度為401 bp，且條帶清晰，可用于后續(xù)酶切反應(yīng)(圖1、2)。

2.2 兩組SNP基因型和等位基因分布 基因型和等位基因頻數(shù)分布在對(duì)照組和病例組研究對(duì)象中分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=1.061，P=0.588；χ2=0.028，P=0.986)，具有群體代表性。

圖1 FAS基因-1377C>T位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳圖

M：代表50bp遞增的DNA標(biāo)記物(Marker)，1、2、3、4、5、6、7、8 代表G/A 基因型只有284 bp 一條片段

圖2 FASL基因-844C>T位基因型PCR產(chǎn)物電泳圖

M：代表50bp遞增的DNA 標(biāo)記物(Marker)，1、2、3、4、5、6、7、8 代表C/T基因型只有401 bp一條片段

病例組和對(duì)照組研究對(duì)象基因型、等位基因頻數(shù)分布組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(fisher=0.282,P=1.0)、(χ2=0.046,P=0.829)、(fisher=2.178,P=0.334)、(χ2=2.393,P=0.122)。詳見表2，表3。

表2 兩組患者FAS-1377 G/A SNP基因型和等位基因分布 (n；%)

注：P>0.05，在病例組合對(duì)照組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。①表示有兩個(gè)單元格的理論頻數(shù)<5,采用fisher確切概率值

表3 兩組患者FASL-844 C/T SNP基因型和等位基因分布 (n；%)

注：P>0.05，在病例組合對(duì)照組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。①表示有兩個(gè)單元格的理論頻數(shù)<5,采用fisher確切概率值

2.3 用logistic回歸分析4種模型， FasL-844基因攜帶T者患PDR風(fēng)險(xiǎn)可能升高，TC,TT,TC+TT,T，OR值分別為1.885，4.308，2.154，1.980，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4，表5)。

表4 病例組和對(duì)照組間FAS-1377G/A SNP的基因型及等位基因分布 (n；%)

表5 病例組和對(duì)照組間FASL-844C/T SNP的基因型及等位基因分布 (n；%)

2.4 同時(shí)攜帶FAS-1377GG和FASL-844CT/TT基因型的風(fēng)險(xiǎn)較同時(shí)攜帶FAS-1377GG和FASL-844CC基因型增加患增殖期2型糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.143(95%CI=0.141-9.289)；OR=0.343(95%CI=0.052-2.261))；OR=2.286(95%CI=0.185-28.186)，P均>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表6)。

表6 糖尿病視網(wǎng)膜病變病例組和對(duì)照組間FAS-1377&FASL-844的基因型及等位基因分布 (n；%)

3 討 論

近年來，DR致病基因多態(tài)性的研究不斷深入，現(xiàn)已篩選出與發(fā)病相關(guān)聯(lián)的基因有數(shù)十種，如白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)基因、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)基因、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)基因等，這些基因在參與DR的發(fā)生與發(fā)展過程中有不同程度的相關(guān)性[3]。如此多的基因多態(tài)性與DR的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)，說明DR(DR不分1型和2型)是發(fā)病機(jī)制眾多、由多種因素參與并與遺傳相關(guān)的一組基因多態(tài)性疾病[4]。

Fas基因(10q24.1，又名CD9/APO-1),屬于腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體家族[5]。是含有325個(gè)氨基酸的膜蛋白。Fas基因?yàn)镕asL基因的受體，F(xiàn)asL是以三聚體的形式存在,必須有3個(gè)Fas受體與1個(gè)FasL結(jié)合,通過Fas胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域與FADD(fas-associated protein with death domain)梭基端的死亡結(jié)構(gòu)域相互連接,募集細(xì)胞中的FADD,同時(shí)與Caspase-8酶原中的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域相互作用,形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(death-inducing signing complex,DISC)[6]，啟動(dòng)凋亡程序,激活下游分子鏈,降解細(xì)胞蛋白質(zhì)、骨架和核酸等,目前認(rèn)為這可能是糖尿病視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞調(diào)亡的重要執(zhí)行途經(jīng)[7]。FAS/FASL基因變異型增加DR的患病風(fēng)險(xiǎn)的原因是[8]：Fas/FasL基因啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)(SNPs)破壞了Fas基因低表達(dá)，出現(xiàn)Fas基因的高表達(dá)，因此FAS/FASL的結(jié)合啟動(dòng)了視網(wǎng)膜周細(xì)胞凋亡[9]。

本文提示 FasL-844基因攜帶T者患DR風(fēng)險(xiǎn)可能升高，TC,TT,TC+TT,TOR值分別為1.885，4.308，2.154，1.980，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。攜帶FAS-1377GG和FASL-844 CT/TT基因型的較同時(shí)攜帶FAS-1377GG和FASL-844CC基因型增加患糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.143(95%CI=0.141-9.289)；OR=0.343(95%CI=0.052-2.261)；OR=2.286(95%CI=0.185-28.186)，P均>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)在病例組及對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)與FAS/FASL基因的相關(guān)性，由此說明該位點(diǎn)相關(guān)性確實(shí)很低。初步認(rèn)為存在以下問題：首先本組分析篩查樣本量較少，F(xiàn)AS/FASL基因多態(tài)性啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡與DR的關(guān)系有待進(jìn)一步驗(yàn)證。其次FAS-1377G>A/FASL-844C>T基因存在多態(tài)異質(zhì)性，如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤與該位點(diǎn)的相關(guān)性已確認(rèn)，但房水、視網(wǎng)膜檢測(cè)的相關(guān)性是否存在差異并未得到驗(yàn)證，而靜脈血檢測(cè)與該位點(diǎn)的相關(guān)性較低；再次Itoh N等對(duì)不同人種DR的基因SNPs位點(diǎn)與之發(fā)生的相關(guān)性進(jìn)行了研究[10]：認(rèn)為FAS/FASL基因自身存在高度遺傳異質(zhì)性，在不同地區(qū)和不同種族人群的遺傳環(huán)境差異性導(dǎo)致不同組織，不同生活習(xí)慣、不同背景因素等方面差異較大[11]，甚至在亞洲人群中也不盡相同，如AR基因(-106CC)基因型可能是美國及巴西2型糖尿病患者的易感基因[12]；在印度某地區(qū)2型糖尿病與VEGF基因啟動(dòng)區(qū),5′-UTR的基因多態(tài)性是DR的主要危險(xiǎn)因素[13]，677C-T等位基因可能是日本患者的DR易感基因[14]，說明同一基因在不同區(qū)域的致病性并不相同，或同一區(qū)域、不同民族對(duì)同一基因的易感性也不一樣。

本文結(jié)果提示FAS-1377G>A/FASL-844C>T基因多態(tài)性可能不是中國云南昆明地區(qū)DR患者的常見易感基因。這是否因樣本量原因所致，還有待進(jìn)一步增加樣本量，對(duì)糖尿病進(jìn)行分型，并對(duì)房水、視網(wǎng)膜等不同部位進(jìn)行FAS/FASL基因基因多態(tài)性的檢測(cè)，以多方位揭示FAS/FASL基因多態(tài)性與DR的關(guān)聯(lián)性。

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(2017-07-06收稿 2017-12-20修回)

AssociationofFAS/FASLgenepolymorphismswithdiabeticretinopathyinKunmingHanpopulations

ZHANG Xian1，LI Yuanyuan1，LI Xuejiang1，ZHANG Yan1,HU Tinghua2,and MA Junyan2.1.Department of Servicemen’s Wards;2.Department of Special Examination,Yunnan Provincial Corps Hospital of PAPF,Kunming 650111,China

ObjectiveTo investigate the association between polymorphisms of Fas promoter-1377 and FasL promoter-844 and diabetic retinopathy (DR) in Kunming Han populations.MethodsPolymerase chain reaction (PCR)and restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) analysis techniques were used to screen the distribution of the genotypic and allelic frequencies of the Fas-1377 and FASL-844 gene among 31 patients with diabetic retinopathy and 23 healthy controls with normal glucose tolerance.ResultsThe frequencies of three genotypes-AA, AG and GG-at the Fas-1377 locus in the control group were 9.7%, 54.8% and 35.5%, respectively, compared to 13%, 52.2% and 34.8% respectively in the case group.There was no statistically significant difference in genotype frequency distribution between the two groups (fisher=0.282,P=1.0). Allele A and G frequency in the control group was 37.1% and 62.9% respectively, but was 39.1% and 60.9% respectively in the case group. There was no statistically significant difference between the two groups in allele frequency distribution (χ2=0.046,P=0.829). Allele frequencies of C and T in the control group were 64.5% and 35.5% respectively, compared with 78.3% and 21.7% in the case group. Logistic regression analysis of the four models suggested that FasL-844 gene T could increase the risk for diabetic retinopathy. The values of TC, TT, TC+TT and TOR were 1.885, 4.308, 2.154 and 1.980 respectively,P>0.05, so there was no statistically significant difference. At the same time,carrying FAS-1377 GG and FASL-844 CT/TT gene was more likely to increase the risk of diabetic retinopathy than carrying FAS-1377 CC genotype GG and FASL-844(OR=1.143 (95%CI=0.141-9.289);OR=0.343 (95%CI=0.052-2.261);OR=2.286 (95%CI=0.185-28.186),Pvalues>0.05.ConclusionsNeither Fas-1377 nor FasL-844 gene polymorphisms have any relationships with diabetic retinopathy in Kunming Han populations, and neither of them may be the susceptible gene of diabetic retinopathy.

diabetic retinopathy; Fas-1377; FasL-844; gene polymorphism

張 嫻，碩士，主治醫(yī)師。

650111 昆明，武警云南總隊(duì)醫(yī)院：1.軍人病區(qū)，2.特檢科

R774.1

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