朱昱宏，劉 沖，鄭文忠，董道全，張恩溥，范龍龍，李賢新,2

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿外科，廣東省男性生殖與遺傳實驗室，廣東深圳 518036； 2.深圳市孫逸仙心血管醫(yī)院外科，廣東深圳 518112； 3.鄭州大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南鄭州 450052)

睪丸原發(fā)性淋巴瘤(primary lymphoma of testis，PLT)是一種罕見的結(jié)外非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin lymphoma，NHL),約占睪丸惡性腫瘤的5%，占NHL的1%～2%[1]。其主要臨床病理類型為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤[2]。研究發(fā)現(xiàn)，睪丸免疫環(huán)境異常與PLT免疫監(jiān)視機制衰減及免疫逃逸密切相關(guān)[3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，樹突細(xì)胞免疫表型及胞內(nèi)因子異常在睪丸精原細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程起重要作用[4]。本研究通過免疫組化(immunohistochemistry，IHC)染色技術(shù)檢測樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)亞群(myeloid DCs、stromal DCs、plasmacytoid DCs)在正常及PLT睪丸組織中的表達(dá)及分布，并分析DCs在PLT發(fā)病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本收集與制備篩選符合研究標(biāo)準(zhǔn)PLT睪丸病理組織石蠟標(biāo)本(7例)、年齡在45至60歲之間，正常睪丸組織標(biāo)本(10例)、年齡在34至59歲之間，登記病例資料(用藥史、外傷史、和生育史等)、診斷標(biāo)準(zhǔn)和篩選標(biāo)準(zhǔn)，并填寫《知情同意書》。本研究正常對照睪丸組織標(biāo)本選自2009～2012年我院泌尿外科前列腺癌睪丸去勢手術(shù)或睪丸外傷行睪丸切除患者，PLT標(biāo)本選自2005～2016年我院泌尿外科因睪丸腫瘤行睪丸切除術(shù)者。納入本研究標(biāo)準(zhǔn)為：睪丸(及附屬結(jié)構(gòu))為首要診斷部位，診斷3個月后未見其他器官病灶，我院2名病理科醫(yī)師同時確定診斷為PLT(彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤)。所有樣本均經(jīng)過多聚甲醛固定(4%濃度)并常規(guī)石蠟包埋處理備用。

1.2主要試劑及儀器CD11c鼠抗人單克隆抗體(武漢三鷹公司)，CD1a鼠抗人多克隆抗體(Abcam，UK)，DC-SIGN兔抗人多克隆抗體(Abcam，UK)，BDCA-2 兔抗人單克隆抗體(武漢三鷹公司)，IDO兔抗人多克隆抗體(Abcam，UK)，CD83鼠抗人多克隆抗體(Abcam，UK)，HLA-DR鼠抗人單克隆抗體(Abcam，UK)，DAB(福州邁新生物科技有限公司)，UltraSensitiveTM SP(鼠/兔)試劑盒(福州邁新生物科技有限公司)，萊卡顯微鏡DM4000b。

1.3免疫組織化學(xué)染色(二步法) 石蠟標(biāo)本切片，切片厚度為5 μm，附于防脫玻片，烘干處理。二甲苯脫蠟處理(兩次，每次20 min)，進(jìn)行梯度乙醇水化標(biāo)本(100%、100%、95%、95%、80%、75%)。過氧化氫(0.3%)避光孵育20 min，Tris-EDTA(pH=10.00)微波加熱修復(fù)20 min，自然冷卻。BSA封閉45 min(室溫)，一抗(最遠(yuǎn)濃度)4度冰箱孵育過夜，二抗溫箱(37 ℃)孵育45 min，DAB顯示反應(yīng)，蘇木紫染核，水化及透明處理，中性樹膠封片。陰性對照采用相應(yīng)IgG替代一抗孵育過程。

2 結(jié) 果

2.1CD11c在正常及PLT睪丸組織中的表達(dá)與分布正常睪丸可見少量CD11c+mDCs表達(dá)分布于睪丸間質(zhì)區(qū)域，精曲小管內(nèi)生精細(xì)胞亦可見CD11c表達(dá)；PLT組織內(nèi)可見大量CD11c+mDCs呈浸潤性分布；二者組間差異有顯著性(P<0.05)(圖1)。

2.2DC-SIGN在正常及PLT睪丸組織中的表達(dá)與分布正常睪丸可見少量DC-SIGN+sDCs表達(dá)分布于睪丸間質(zhì)區(qū)域，精曲小管內(nèi)生精細(xì)胞及支持細(xì)胞亦可見DC-SIGN表達(dá)；PLT組織內(nèi)可見大量DC-SIGN+sDCs呈浸潤性分布；二者組間差異有顯著性(P<0.05)(圖1)。

2.3CD1a在正常及PLT睪丸組織中的表達(dá)與分布正常睪丸可見少量CD1a+DCs表達(dá)分布于睪丸間質(zhì)區(qū)域；PLT組織內(nèi)可見CD1a+DCs散在分布；二者組間差異有顯著性(P<0.05)(圖1)。

2.4BDCA-2在正常及PLT睪丸組織中的表達(dá)與分布正常及PLT睪丸組織均可見少量BDCA-2+漿樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid DCs，pDCs)呈散在分布，；二者組間差異無顯著性(P>0.05)(圖2)。

2.5HLA-DR、CD83及IDO在正常及PLT睪丸組織中的表達(dá)與分布正常睪丸可見少量HLA-DR+細(xì)胞散在分布于睪丸間質(zhì)區(qū)域，PLT組織內(nèi)可見大量HLA-DR+細(xì)胞呈浸潤性分布；二者組間差異有顯著性(P<0.05)(圖3)；正常睪丸可見IDO呈散在分布于睪丸間質(zhì)區(qū)域，PLT組織內(nèi)可見大量IDO+細(xì)胞呈浸潤性分布，二者組間差異有顯著性(P<0.05)(圖3)；本研究未發(fā)現(xiàn)CD83+DCs在正常及PLT睪丸組織中表達(dá)。

圖1IHC分析CD11c、DC-SIGN、CD1a在正常及PLT睪丸組織中的表達(dá)(×200；×400)及其柱狀圖

A:CD11c的表達(dá)；B：DC-SIGN的表達(dá)；C：CD1a的表達(dá)。小線框(×200)代表目標(biāo)區(qū)域；右下角大方框代表目標(biāo)區(qū)域×400視野；*代表生精小管管腔；箭頭代表陽性細(xì)胞。標(biāo)尺為100 μm。

圖2 IHC 分析BDCA-2在正常及PLT睪丸組織中的表達(dá)(×200；×400)及其柱狀圖

小線框(×200)代表目標(biāo)區(qū)域；右下角大方框代表目標(biāo)區(qū)域×400視野；*代表生精小管管腔；箭頭代表陽性細(xì)胞。標(biāo)尺為100 μm。

圖3 IHC 分析HLA-DR及IDO在正常及PLT睪丸組織中的表達(dá)(×200；×400)及其柱狀圖

A:HLA-DR的表達(dá)；B：IDO的表達(dá)。小線框(×200)代表目標(biāo)區(qū)域；右下角大方框代表目標(biāo)區(qū)域×400視野；*代表生精小管管腔；箭頭代表陽性細(xì)胞。標(biāo)尺為100 μm。

3 討 論

PLT是一類較為罕見的結(jié)外淋巴瘤，常見于老年患者[5]。絕大多數(shù)PLT為NHL，主要病理類型為彌漫性大細(xì)胞性淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤或其它病理類型少見[6]。免疫表型方面，PLT主要為B系、T系及T/NK細(xì)胞性淋巴瘤少見[7-8]。PLT發(fā)展快速，預(yù)后較差，其5年生存率為16%～50%[9]。研究表明，睪丸免疫環(huán)境異常與免疫監(jiān)視機制衰減及腫瘤細(xì)胞免疫逃逸過程密切相關(guān)[4]。本研究通過IHC分析正常及PLT患者睪丸組織中DCs亞群及分布，發(fā)現(xiàn)DCs在PLT患者睪丸組織中表達(dá)水平顯著增高，提示睪丸DCs異常在PLT免疫監(jiān)視機制衰減及腫瘤細(xì)胞免疫逃逸過程中可能發(fā)揮重要作用。

DC是最強的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，作為連接機體固有免疫及適應(yīng)性免疫的“橋梁”，是機體產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動者[10-12]。按DCs來源、分布、分化程度及免疫功能可將其分為：mDCs、pDCs、郎格漢斯細(xì)胞、sDCs、未成熟性DCs、成熟性DCs、耐受性DCs及炎癥性DCs[13]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，精原細(xì)胞瘤中CD11c+mDCs表達(dá)水平較正常睪丸組織顯著增高，這類CD11c+mDCs呈集落狀分布，并表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-Dioxygenase，IDO)，在誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)/輔助性T細(xì)胞17(helper T cell 17，Th17)，輔助性T細(xì)胞1/輔助性T細(xì)胞2(helper T cell 1/ helper T cell 2，Th1/Th2)向耐受性極化過程中起重要作用[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，PLT睪丸組織中CD11c+mDCs與IDO表達(dá)水平較正常水平顯著增高，提示CD11c+mDCs可能通過表達(dá)分泌IDO調(diào)控Treg或Th2極化過程，進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸過程。

DC特異性ICAM抓取非整合素(DC-specific ICAM-grabbing non-integrin，DC-SGN)，為II型跨膜受體，是DCs表面C凝集素受體(c-type lectin receptors，CLRs)的主要成員，其可通過識別人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)包膜蛋白(gp120)捕獲病毒,并將其傳遞給T淋巴細(xì)胞，造成T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)異常[14]。DC-SIGN為sDCs的相對特征標(biāo)記物，在成熟型DC中表達(dá)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)睪丸間質(zhì)散在分布DC-SIGN+DCs，提示其在維持睪丸免疫屏障穩(wěn)態(tài)中起重要作用。此外，其可作為HIV病毒殘留于獲得性免疫缺陷綜合征患者睪丸的接合點[16]。DC-SIGN+DCs在PLT中的表達(dá)及作用至今仍無相關(guān)文獻(xiàn)報道，本實驗通過IHC染色發(fā)現(xiàn)PLT睪丸組織大量浸潤DC-SIGN+，提示PLT睪丸組織相關(guān)DCs分化水平較高，具有一定調(diào)控T淋巴細(xì)胞分化的作用。

CD1a的生物學(xué)作用是呈遞脂類抗原的分子，其作為郎格漢斯細(xì)胞(langerhans cell，LCs)的特征性標(biāo)志物。LCs主要分布于表皮，其在抗病原微生物侵入及免疫監(jiān)視腫瘤細(xì)胞中起關(guān)鍵作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)PLT睪丸組織CD1a+DCs較正常顯著增加，但是CD1a總表達(dá)豐度較低，由此我們推測，PLT發(fā)生過程中CD1a+DCs表達(dá)水平升高有限，無法有效清除腫瘤細(xì)胞，造成腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。

正常生理條件下，pDCs主要分布于外周血及次級淋巴組織器官。pDCs對機體外源性抗原物質(zhì)提呈較弱，其主要通過TLR7及TLR9提呈內(nèi)源性抗原物質(zhì)，并可通過釋放I類干擾素活化CD4+T，CD8+T及自然殺傷細(xì)胞(nature killer cells，NKs)，發(fā)揮免疫防御作用[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)正常及PLT組織中均有少量BDCA-2+pDCs表達(dá)，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

HLA-DR是Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)。本研究發(fā)現(xiàn)PLT及正常睪丸組織中均表達(dá)HLA-DR，且PLT睪丸組織HL-DR表達(dá)水平較正常睪丸組織顯著增高，提示PLT睪丸組織相關(guān)DC，分化相對成熟，并具有一定抗原提呈功能。由此我們推測PLT發(fā)生過程中APC表達(dá)HLA-DR水平隨腫瘤抗原增加而增高，但無法誘導(dǎo)有效的T淋巴細(xì)胞殺傷機制。

綜上所述，本研究通過分析正常及PLT睪丸組織中各DCs亞群改變，發(fā)現(xiàn)正常睪丸間質(zhì)中DCs為未完全成熟型，提示其在維持睪丸免疫屏障中發(fā)揮重要作用。在PLT患者睪丸組織中，mDC、sDCs及CD1a+DCs表達(dá)水平顯著增高，且主要表現(xiàn)為具有一定成熟度及抗原提呈功能的耐受型DCs，提示其可能通過表達(dá)DC-SIGN、HLA-DR并分泌IDO等耐受性細(xì)胞因子調(diào)控Treg或Th2極化過程，進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸過程。本研究為精原細(xì)胞瘤免疫診斷提供新的潛在指標(biāo)，對開發(fā)設(shè)計精原細(xì)胞瘤免疫治療方案具有一定的臨床意義。

值得注意的是，本研究僅通過IHC染色初步探討PLT相關(guān)DCs的表型特征，進(jìn)一步需要通過PCR、Western blot及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行驗證。此外，仍需體外細(xì)胞功能實驗研究其確切分子生物學(xué)機制。

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