袁志俊，何曉英，李嬌紅，李小剛

蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 (janus kinase 2-signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)通路是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，它介導(dǎo)了多種因子的信號(hào)傳導(dǎo)，如干擾素(IFN)白介素-2、表皮性生長因子(EGF)、血小板衍生因子(PDGF)、G-CSF、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等的共同通路，在血管生成、細(xì)胞增殖分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，JAK2/STAT3通路激活與腦損傷密切相關(guān)，它參與腦出血、腦缺血、蛛網(wǎng)膜下隙出血等的調(diào)控[1-2]。α-氰基-(3，4-羥基)N-芐苯乙烯胺[Alpha cyano-(3-hydroxy)] N-styrene benzyl amine，AG-490)是JAK2/STAT3信號(hào)通路的特異性拮抗劑，結(jié)構(gòu)類似酪氨酸，可以和受體酪氨酸激酶競爭結(jié)合位置，抑制應(yīng)激反應(yīng)時(shí)STAT3的磷酸化，從而降低STAT3的活性[3]。VEGF又稱血管通透因子(VPF)，是胎兒和成人血管發(fā)生和血管生成過程中重要的調(diào)控因子。VEGF是特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的糖基化細(xì)胞有絲分裂素，在增強(qiáng)血管的滲透性、誘導(dǎo)血管發(fā)生和血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用。由于mRNA不同的剪切方式，產(chǎn)生了VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189和VEGF206等6種蛋白形式。其中VEGF165是人類組織中VEGF主要的基因產(chǎn)物，也是VEGF家族中最重要的血管生成調(diào)節(jié)因子。李耀汝等[4]研究表明， JAK2/STAT3信號(hào)通道可能參與介導(dǎo)腦缺血小鼠VEGF的表達(dá)。Dong等[5]研究表明：AG-490可抑制STAT3的磷酸化，進(jìn)而減少VEGF mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致VEGF蛋白的表達(dá)減少，抑制腦卒中誘導(dǎo)的血管生成。本實(shí)驗(yàn)使用AG-490干預(yù)，檢測血腫周圍VEGF165及磷酸化JAK2(P-JAK2)、磷酸化STAT3(P-STAT3)的表達(dá)變化，旨在探討JAK2/STAT3途徑在腦出血后血管生成的作用，為明確腦出血后的血管變化情況及機(jī)制提供治療指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠75只，體質(zhì)量200 g～320 g，鼠齡(3～4)個(gè)月，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦出血組和AG-490干預(yù)組，各組25只。按造模成功后時(shí)間將各組大鼠再分為6 h、24 h、48 h、72 h、7 d共5個(gè)亞組，每亞組5只。1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 VEGF165抗體、P-JAK2和P-STAT3單克隆抗體、AG-490、SDS-PAGE凝膠、5%牛血清白蛋白、SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購自巴傲得生物科技有限公司。鼠腦立體定向儀(由西南醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供)，50 μL微量注射儀購自世界精密儀器商貿(mào)(上海)有限公司，其他儀器包括Olympus光學(xué)顯微鏡、光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)、Image-J圖像分析系統(tǒng)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腦出血模型制備 采用改良的二次注入法建立腦出血模型[6]。以尾動(dòng)脈為供血?jiǎng)用}，有一定創(chuàng)傷，但不影響大鼠肢體的功能，行為學(xué)評(píng)分更準(zhǔn)確，成功率高。術(shù)畢根據(jù)Longa等[7]5級(jí)評(píng)定方法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，1分～3分為腦出血造模成功。AG-490組大鼠于造模成功后立即給予腹腔注射AG-490(0.15 mg/kg)，共3 d。假手術(shù)組大鼠按相同方案注入等量生理鹽水。

1.3.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分(NSS) 采用Garcia等[8]NSS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，包括運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡測試、反射消失或不正常運(yùn)動(dòng)、行走。18 分為正常，13分～17分為輕度損害，7分～12 分為中度損害，1分～6分為重度損害。

1.3.3 免疫組化 采用免疫組織化學(xué)法檢測VEGF165蛋白的表達(dá)。選擇5個(gè)不重疊的血腫區(qū)域采集圖像，然后用Image-Pro-Plus5.0軟件分析蛋白陽性表達(dá)的累積光密度值，并計(jì)算平均值。

1.3.4 Western blotting檢測 采用Western blotting檢測P-JAK2和P-STAT3的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。分析蛋白條帶的相對(duì)密度。

2 結(jié) 果

2.1 各組NSS評(píng)分比較 各時(shí)間點(diǎn)腦出血組和AG-490組NSS評(píng)分均低于假手術(shù)組(P<0.05)，AG-490組NSS評(píng)分高于腦出血組(P<0.05)。腦出血和AG-490組大鼠造模成功后48 h神經(jīng)功能缺損最嚴(yán)重(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠造模成功后不同時(shí)間NSS評(píng)分比較(±s) 分

2.2 各組免疫組化情況 假手術(shù)組可見較少量VEGF165表達(dá)；腦出血組和AG-490組6 h血腫周圍可見少量VEGF165表達(dá)，48 h達(dá)高峰(P<0.05)，7 d仍有少量表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均高于假手術(shù)組(P<0.05)，AG-490組各時(shí)間點(diǎn)VEGF165表達(dá)均低于腦出血組(P<0.05)。詳見表2、圖1。

表2 各組大鼠造模成功后不同時(shí)間點(diǎn)VEGF165的表達(dá)(±s)

A為假手術(shù)組；B為腦出血組；C為AG-490組；箭頭所示為VEGF165陽性細(xì)胞。

2.3 各組Western blotting檢測 各組大鼠血腫周圍組織P-JAK2和P-STAT3表達(dá)變化趨勢(shì)與VEGF165變化一致。詳見表3、表4和圖2。

表3 各組大鼠造模成功后不同時(shí)間點(diǎn)P-JAK2表達(dá)的相對(duì)吸光度值比較 (±s)

表4 各組大鼠造模成功后不同時(shí)間點(diǎn)P-STAT3表達(dá)的相對(duì)吸光度值比較(±s)

圖2 各組大鼠血腫周圍P-JAK2和P-STAT3表達(dá)

2.4 相關(guān)性分析 腦出血組大鼠NSS評(píng)分與VEGF163表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.511，P<0.05)，VEGF163與P-JAK2、P-STAT3的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.562，P<0.05；r=0.479， P<0.05)。

3 討 論

JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)是指細(xì)胞外的刺激激活信使物質(zhì)，激活的信使識(shí)別并結(jié)合于胞膜的受體，同時(shí)誘導(dǎo)其在胞漿內(nèi)形成JAK2結(jié)合位點(diǎn)并使JAK2發(fā)生磷酸化并暴露STAT3的錨定點(diǎn)，從而STAT3磷酸化而活化并移向胞核內(nèi)，完成與目的基因的信號(hào)傳導(dǎo)和表達(dá)調(diào)控[9-10]。因此，通過測定 P-JAK2和P-STAT3蛋白的表達(dá)，可以動(dòng)態(tài)了解JAK2/STAT3信號(hào)通路的活化情況。AG-490可以選擇性拮抗JAK2酪氨酸磷酸化，有效阻斷其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子STAT3的活化，最終阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路[3]。AG-490能影響人的多項(xiàng)生命活動(dòng)，如可顯著縮小腦梗死面積，減少細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能缺損；亦可抑制骨髓瘤淋巴細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[11]。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示[2]：大鼠腦出血后腦組織P-JAK2、P-STAT3表達(dá)增多，JAK2/STAT3通路激活，其可能參與腦損傷的過程；P-JAK2和P-STAT3在AG-490組表達(dá)較假手術(shù)組高，而較腦出血組低，表明AG-490能有效地阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路。

VEGF發(fā)現(xiàn)于1989年，是一種能特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，是目前公認(rèn)為作用最強(qiáng)、特異性最高的一種促血管生成因子。VEGF家族成員包括：VEGF-A、VEGF-B、胎盤生長因子(PIGF)、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和它們的受體VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3及Neuropilins，VEGF受體特異性地分布于血管內(nèi)皮等細(xì)胞，VEGF通過與其受體的結(jié)合而發(fā)揮促進(jìn)血管新生和增強(qiáng)血管通透性的生理功能。在人類，VEGF-A占主導(dǎo)作用，其共有8種亞型，包括：VEGF121，VEGF145，VEGF148，VEGF165，VEGF165b，VEGF 183，VEGF 189和VEGF206，其中VEGF 121和VEGF 165是主要的分泌亞型[12-13]。VEGF165是由165個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，是一種分泌性生長因子，廣泛地存在于多種組織細(xì)胞中，不僅具有促進(jìn)血管生成活性，而且其表達(dá)產(chǎn)物是可溶性的，表達(dá)后可從細(xì)胞中分泌出來，擴(kuò)散性強(qiáng)，易到達(dá)靶細(xì)胞，能很好地發(fā)揮生物學(xué)活性[14]。李耀汝等[4]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JAK2/STAT3信號(hào)通路參與腦缺血后血管的生成等許多重要的生物學(xué)過程，而血管的生成有助于神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)重塑，促進(jìn)腦缺血后行為功能改善。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：AG-490組NSS評(píng)分較假手術(shù)組低，較腦出血組高，P-JAK2、P-STAT3、VEGF165的表達(dá)較假手術(shù)組高，而較腦出血組低，且P-JAK2、P-STAT3與VEGF165的表達(dá)呈正相關(guān)，表明在SD大鼠造模后腹腔注射通道阻斷劑AG-490，可下調(diào)VEGF165在大鼠血腫周圍的表達(dá)，阻斷腦出血后的血管生成，進(jìn)而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，此作用可能由JAK2/STAT3參與介導(dǎo)。Dong等[5]研究梓醇對(duì)腦卒中后大鼠神經(jīng)功能保護(hù)作用的機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)：AG-490可抑制STAT3的磷酸化，進(jìn)而減少VEGF mRNA表達(dá)，導(dǎo)致VEGF蛋白表達(dá)減少，抑制腦卒中誘導(dǎo)血管生成，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

JAK2/STAT3信號(hào)通路可能通過上調(diào)VEGF165的表達(dá)，促進(jìn)大鼠腦出血后血腫周圍的血管生成，加快腦損傷后的修復(fù)，從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用，此研究可為進(jìn)一步明確腦出血后血管生成在腦損傷后修復(fù)過程中的機(jī)制及治療提供新的思路。

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