王冰艷，王文慧，張艷虹，徐鳳芹

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種在動脈內(nèi)膜沉積過多脂質(zhì)的慢性炎癥性疾病[1]，脂質(zhì)代謝異常是其主要危險因素。大量基礎和臨床研究表明，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝異?？蓽p緩AS發(fā)生發(fā)展。歐洲心臟病學會與動脈硬化學會亦指出，調(diào)脂應貫穿于心腦血管病防治過程始終[2]。AS作用機制及防治策略是近年來心血管領域研究的熱點和難點。中醫(yī)認為AS屬于“脈濁”病的范疇[3]，血濁阻滯脈絡為其病機特點。已有研究證實，化濁通脈類的中藥單體和復方通過調(diào)脂、抗炎等作用發(fā)揮防治AS的作用，在臨床上展示出良好的應用前景[4-6]。本研究旨在通過構(gòu)建新西蘭大耳兔AS模型，應用不同劑量化濁通脈方干預，初步探討其防治AS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭大耳白兔60只，雄性，(8～12)周齡，由北京芳園養(yǎng)殖有限責任公司繁殖飼養(yǎng)，實驗動物合格證號：SCXK(京)2014-0012，實驗前經(jīng)7 d普通飼料適應性喂養(yǎng)。

1.2 藥物及飼料 化濁通脈方：藥物組成為虎杖、荷葉、山楂等六味中藥，委托中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號：20150802。辛伐他汀片(商品名：舒降之)，每片20 mg，由杭州默沙東公司生產(chǎn)，批號K014576。普通飼料和高脂飼料均由北京華阜康生物科技股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號SCXK(京)2014-0010。其中高脂飼料配方：1%膽固醇，15%蛋黃粉，1%豬油，83%普通飼料。

1.3 實驗儀器 全自動生化分析儀：日本HITACHI(7600-020型)，離心機：美國SIGMA(3K15型)，顯微鏡：日本OLYMPUS BX51T-PHD-111(日本Nikon E200)，切片機：德國Leica RM2016。

1.4 模型制備與分組 應用高脂飼料喂養(yǎng)法建立新西蘭兔AS模型[7-8]，采用隨機數(shù)字表法將60只新西蘭大耳白兔隨機分為5組，每組12只，即對照組、模型組、化濁通脈方小劑量(HZTML)組、化濁通脈方大劑量(HZTMH)組和辛伐他汀(Sm)組。對照組：予普通飼料喂養(yǎng)22周；模型組：予高脂飼料喂養(yǎng)14周，普通飼料喂養(yǎng)8周；Sm組、HZTML組和HZTMH組分別給予高脂含藥飼料喂養(yǎng)14周，后8周喂養(yǎng)普通含藥飼料，其中Sm組飼料含辛伐他汀2 mg/(kg·d)，HZTML組飼料含化濁通脈方6.5 g/(kg·d)，HZTMH組飼料含化濁通脈方13 g/(kg·d)。其中，HZTML組每日給藥劑量等同于成人每日臨床推薦常用劑量，HZTMH組每日給藥劑量等同于HZTML組的2倍。

1.5 取材及指標檢測

1.5.1 組織病理學檢測 第22周末當日以空氣栓塞法處死兔，取出胸主動脈至腹主動脈分叉處上端組織，從中間剖開置于預冷培養(yǎng)皿上展平拍攝大體樣本，觀察主動脈脂紋脂斑形成。按順序分解主動脈管壁，取胸主動脈分叉處置于中性甲醛固定后進行HE染色觀察。

1.5.2 血脂水平測定 分別于實驗前、實驗14周末當日及22周末當日空腹禁食8 h后，經(jīng)耳緣靜脈采血5 mL置于抗凝管中，離心，取上清液置于-80 ℃冰箱中備用。應用酶聯(lián)免疫吸附法測定總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇( HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)、載脂蛋白B(ApoB)、載脂蛋白A1(ApoA1)水平。

2 結(jié) 果

2.1 動物一般情況 各組實驗動物均存在不同程度的飲食量減少、腹瀉等癥狀，以實驗前期最頻繁、嚴重。至第22周末，共死亡15只，分別是對照組2只、模型組4只、HZTML組2只、HZTMH組4只、Sm組3只。

2.2 形態(tài)學觀察 22周后各組兔胸主動脈管壁肉眼觀察，對照組管壁光滑，無脂質(zhì)沉積；模型組管壁明顯脂質(zhì)條紋形成，斑塊滿布，提示AS兔模型制備成功；Sm組及HZTMH組管壁也可見散在斑塊形成，但范圍較??；HZTML組管壁可見明顯斑塊，但較模型組范圍小。表明大劑量化濁通脈方能抑制兔AS斑塊的形成并減輕硬化程度(見圖1)。

1為對照組；2為模型組；3為Sm組；4為HZTML組；5為HZTMH組。

22周后各組胸主動脈分叉處石蠟切片經(jīng)HE染色后在光學顯微鏡下觀察，對照組平滑肌細胞排列整齊、緊密有序，內(nèi)皮細胞層連續(xù)，內(nèi)皮下無脂質(zhì)沉積，各層結(jié)構(gòu)清晰；模型組內(nèi)皮不連續(xù)，內(nèi)膜增生嚴重，管壁內(nèi)滿布斑塊，可見大量泡沫細胞，中外膜不規(guī)則增厚，可見泡沫細胞浸潤； HZTMH組及Sm組均可見內(nèi)皮細胞連續(xù)，內(nèi)膜下見脂質(zhì)沉積，見散在薄斑塊，未見明顯泡沫細胞沉積，中外膜與對照組厚度相當，較模型組薄；HZTML組可見內(nèi)膜不連續(xù)，部分隆起，中外膜增厚，少量泡沫細胞浸潤。詳見圖2。提示：大劑量化濁通脈方能減少泡沫細胞在內(nèi)膜下堆積，減輕血管壁脂質(zhì)沉積，抑制血管平滑肌細胞增殖重構(gòu)，且作用與辛伐他汀相似。

1為對照組；2為模型組；3為Sm組；4為HZTML組；5為HZTMH組。箭頭所示為動脈管壁斑塊，其長度與斑塊厚度相關(guān)。

2.3 血脂水平檢測 給藥14周，與對照組比較，模型組TC、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL-C、ApoA1、ApoB水平均升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，各給藥組TC、LDL-C、ApoB水平降低(P<0.05)，HDL-C、ApoA1水平升高，并對TG、VLDL-C水平有不同程度調(diào)節(jié)，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Sm組比較，HZTML組與HZTMH組TC、TG水平均降低并對LDL-C、VLDL-C、ApoB、 HDL-C、ApoA1水平均有不同程度調(diào)節(jié)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明化濁通脈方大、小劑量組均能不同程度調(diào)節(jié)血脂水平，且與辛伐他汀作用相似。詳見表1。

給藥22周，與對照組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C、VLDL-C、ApoA1、ApoB水平均升高(P<0.05或P<0.01)，HDL-C水平亦升高，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，各給藥組血清TC、LDL-C、VLDL-C、ApoB水平均降低(P<0.05或P<0.01)，TG和HDL-C水平亦降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，ApoA1水平均不同程度升高，以辛伐他汀組顯著(P<0.05)；與Sm組比較，HZTML組與HZTMH組對TG、TC、ApoB、LDL-C、 VLDL-C、HDL-C、ApoA1水平均有不同程度調(diào)節(jié)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。化濁通脈方大、小劑量均能不同程度調(diào)節(jié)血脂水平，且與辛伐他汀作用相似。詳見表2。

表1 各組14周末AS兔血脂等指標水平的影響(±s)

表2 各組22周末AS兔血脂等指標水平的影響(±s)

3 討 論

現(xiàn)代研究表明，AS是冠心病和腦血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中的始動環(huán)節(jié)[9]。其中，血脂異常是AS發(fā)生的主要危險因素[10]。大量研究表明，TC、TG和 LDL-C可促進AS的發(fā)生發(fā)展，而HDL-C對其具有延緩作用[11]。積極降低TC、TG，尤其是LDL-C水平，可延緩AS斑塊進展，防止血栓形成，甚至促進斑塊消退[12]。

化濁通脈方由虎杖、草決明、郁金等6味中藥組成，是中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院徐鳳芹教授結(jié)合多年臨床經(jīng)驗，根據(jù)AS病人以濁、痰、瘀、毒為主要病機特點總結(jié)而成。方中虎杖清濕熱、散瘀毒，為君藥，草決明潤腸通便、分利濁邪為臣藥，郁金行氣通脈為佐使之藥等。全方以化濁祛濕通絡為綱，佐以行氣、清化脂濁之藥，共奏化濁祛濕、散瘀通脈之功，廣泛應用于冠心病、血脂代謝異常病人的防治。目前課題組納入高脂血癥合并頸動脈斑塊形成病人，通過血脂水平檢測和頸部血管超聲觀察，發(fā)現(xiàn)其具有降脂和消斑的作用?；诖耍狙芯客ㄟ^構(gòu)建新西蘭大耳兔AS模型，給予不同劑量化濁通脈方干預22周后進行胸主動脈大體形態(tài)和HE染色觀察以及血脂水平檢測，初步探討該方防治AS的可能機制，為進一步研究提供實驗基礎。

大量臨床研究證實，血清TC、TG和LDL-C水平與AS風險呈正相關(guān)。其中，LDL-C經(jīng)氧化修飾后，可穿過受損的平滑肌細胞間隙，滲入到內(nèi)膜下，在巨噬細胞內(nèi)大量蓄積，進而形成泡沫細胞[13]，最終促進AS的發(fā)生發(fā)展。因此，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減少脂質(zhì)沉積對抑制AS的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。正常的VLDL-C沒有直接致AS的作用，但是VLDL-C代謝后產(chǎn)生的LDL-C具有致AS作用。血清ApoB主要反映LDL-C水平，它與血清LDL-C水平呈明顯正相關(guān)，有研究表明其更能作為冠心病的預測指標[14]。ApoA1是HDL-C的蛋白組成成分，占據(jù)HDL-C 65%～70%的蛋白含量[15-16]，是細胞外膽固醇的主要受體。ApoA1對于HDL-C功能的實現(xiàn)具有重要意義。亦有研究表明，HDL-C功能的實現(xiàn)應關(guān)注其結(jié)構(gòu)組成，而不是水平[17]。HDL-C功能較HDL-C水平能更好地預測動脈粥樣硬化及冠心病發(fā)病風險[18]。

本實驗采用前14周給予高脂飼料喂養(yǎng)造模的同時進行藥物干預，后8周改為普通飼料喂養(yǎng)，同時進行藥物干預，觀察藥物預防AS的同時，探討其在斑塊形成過程和對已有斑塊的治療作用。與一般斑塊消退實驗不同，一方面延長藥物作用時間，實驗開始即給藥，而不是造模成功后再給藥，更好地體現(xiàn)中藥的預防作用；另一方面，并未在造模成功后立即處死模型動物，而是讓模型組也經(jīng)歷消退期，以避免高脂飼料對藥物抗AS作用的干擾。通過胸主動脈大體形態(tài)和HE染色病理形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)造模22周后模型組動脈管壁可見明顯脂質(zhì)條紋形成，斑塊布滿整個管壁，并有泡沫細胞浸潤；各藥物干預組可不同程度抑制動脈粥樣硬化斑塊形成，抑制血管平滑肌細胞增殖重構(gòu)，以大劑量化濁通脈方組和辛伐他汀組作用顯著。對其防治AS作用機制進行了初步探討。給藥14周和22周，模型組血清TC、TG、LDL-C、VLDL-C、ApoA1、ApoB水平均較對照組顯著升高；給予大、小劑量化濁通脈方干預后血脂水平均有不同程度改善，且與辛伐他汀作用相似。其中，應用化濁通脈方對血清HDL-C水平的調(diào)節(jié)作用不明顯，差異無統(tǒng)計學意義，推測是否與其調(diào)節(jié)HDL-C亞型分布有關(guān)，尚需進一步檢測血漿HDL-C顆粒亞型加以驗證。

化濁通脈方可通過調(diào)節(jié)模型兔血脂代謝紊亂達到防治AS的作用，具體作用機制有待進一步研究。

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