★ 陳來 李俊 殷玉婷 陳麗玲 袁可望 舒坤 羅小泉 徐彭 李姍姍

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004)

現(xiàn)有用于新藥臨床前體內(nèi)藥效學(xué)研究的腫瘤動物模型因與人腫瘤實際情況差異較大，導(dǎo)致動物實驗結(jié)果與臨床治療人腫瘤的實際情況相差較遠情況較為常見。如能建立與人腫瘤實際情況差異小，且免疫功能相對正常的人腫瘤異種移植動物模型的可能性，則可提高抗癌新藥和新療法的篩選效率?；谧訉m內(nèi)移植供體細胞，可成功地誘導(dǎo)特異性免疫耐受并維持嵌合體狀態(tài)的原理，我們試圖探討在胚胎時期子宮內(nèi)注射人源腫瘤細胞，建立不會影響模型動物免疫系統(tǒng)對其它免疫活性物質(zhì)免疫反應(yīng)的，獨能允許具有相同抗原特異性的人腫瘤移植物正常生長的異種移植腫瘤動物模型成的可能性。昆明小鼠由于繁殖周期短、多胎妊娠和抵抗力強，是以昆明小鼠為實驗對象。本文以昆明小鼠為實驗對象，探討了注射天數(shù)、孕鼠經(jīng)初產(chǎn)等因素對胎鼠成活率的影響，初步確定了模型建立中子宮移植部分的關(guān)鍵因素。

1 材料

1.1 實驗動物 昆明種小鼠，SPF級，體質(zhì)量18 ～ 22 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號為JZDWNo：43004700007670。所有動物實驗均遵循國家相關(guān)標(biāo)準及實驗動物護理和使用指南進行。

1.2 藥品 戊巴比妥鈉(批號為922L035)，購自Pentobarbital sodium公司；鹽酸布比卡因(批號為D1102A)，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑 甲醛(批號為1307132)，購自西隴化工股份有限公司；PBS(批號為20141215)，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 主要儀器 拉制儀(型號為PC-1)，購自日本成茂公司；微量注射器(型號為IM-9B)，購自日本成茂公司；恒溫臺(型號為TP-SMZSL)，購自日本東海希多公司。

2 方法

2.1 微量注射針的制備 用外徑1mm的毛細玻璃管拉制璃微量注射針頭，通過調(diào)整拉制儀的熔點溫度及拉制重量，使得拉制完成的針頭部分從錐形的開始到針尖的距離約為1cm (見圖1A)。

2.2 實驗動物分組與手術(shù) 選取雄性種鼠和初產(chǎn)或經(jīng)產(chǎn)的雌性種鼠，在交配前分開隔離飼養(yǎng)。下午1∶1合籠，第2d檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓當(dāng)天定為0d。初產(chǎn)或經(jīng)產(chǎn)的孕鼠各選取40只，隨機分為4組，分別于孕14d、15d、16d開腹腔行子宮內(nèi)注射，即向胎鼠腹腔注射20μL的無菌PBS溶液，全部胎鼠注射完成后縫合。假手術(shù)組孕鼠于孕15d進行實驗，但只開腹腔不進行胎鼠腹腔注射，直接縫合。每組孕鼠數(shù)量為10只，如發(fā)生麻醉致死的情況，則補足。

手術(shù)具體方法如下：孕鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液(70mg/kg)。當(dāng)孕鼠麻醉時，準備好注射物，將制備好的玻璃微量注射針頭組裝到微量注射器上。確認麻醉好后，將孕鼠放在恒溫臺上，仰臥，固定。腹部用75%酒精消毒并潤濕，使用雙面刀片剃光腹部毛發(fā)。下腹部做1cm的縱向切口(見圖1B)。用濕潤棉簽輕輕舒展筋膜，并將妊娠子宮從切口中牽出，確定左、右卵巢，記錄胎鼠數(shù)量(見圖1C)后將子宮放回腹腔，以使胎鼠保持溫暖。其后逐只牽出進行注射，術(shù)中不斷用37°C預(yù)熱PBS濕潤子宮。記錄胎鼠注射可能出現(xiàn)的出血、囊液滲出、囊膜外突、胎鼠損傷等手術(shù)并發(fā)癥。

注射時用拇指和食指固定胎鼠，確定胎鼠腹腔位置后將注射針頭依次穿過子宮，羊膜和胎鼠皮膚，進入胎鼠腹腔，每個胎鼠注射20μL PBS(見圖1D)。注射完成后，小心抽離注射針，將胎鼠小心放回腹腔。用5-0編織可吸收縫線縫合筋膜，5-0不可吸收縫線縫合皮膚(見圖1E)。于切口處皮下注射0.025%鹽酸布比卡因溶液(5mg/kg)以減少孕鼠痛苦。將孕鼠放置在保溫臺上保持體溫，直至其醒來。醒來后轉(zhuǎn)移至鋪了厚紗布的籠具里，并置于安靜的區(qū)域直到生產(chǎn)。

第二天檢查孕鼠有無陰道出血、腹部收縮或煩躁等流產(chǎn)征兆。其后每天觀察，注意傷口紅腫、發(fā)炎、傷口分離和感染等癥狀。記錄每組孕鼠分娩及胎鼠成活及體重情況。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準誤表示，用SPSS17.0 軟件包分析，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)評價整體性差異，并進行方差齊性檢驗。采用χ2檢驗、t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05表示有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 手術(shù)并發(fā)癥 3只孕鼠因手術(shù)麻醉過量死亡(初產(chǎn)1假手術(shù)組、初產(chǎn)16d注射組和經(jīng)產(chǎn)16d注射組各1只)，初產(chǎn)孕鼠手術(shù)時妊娠胎鼠數(shù)量為6～18只，經(jīng)產(chǎn)孕鼠為8～20只(見表1)。

除假手術(shù)組外，各組均有出血、囊液滲出、囊膜外突、胎鼠損傷等手術(shù)并發(fā)癥，各組并發(fā)癥與假手術(shù)組相比有顯著性差異(P<0.01)；初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)各注射時間點組之間，以及相同注射時間的初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)組之間無顯著性差異(見表1)。

3.2 妊娠結(jié)局 因正常昆明小鼠生產(chǎn)在孕18～20d之間，故將生產(chǎn)天數(shù)少于18d孕鼠認定為早產(chǎn)孕鼠。共有3只因難產(chǎn)死亡(初產(chǎn)14d注射組、初產(chǎn)15d注射組和經(jīng)產(chǎn)14d注射組各1只)，較初產(chǎn)孕鼠相比，經(jīng)產(chǎn)孕鼠出現(xiàn)難產(chǎn)死亡的情況有所減少(見表2)。

各注射組的胚胎丟失率較假手術(shù)組低，具有顯著性差異(P<0.01)。初產(chǎn)孕鼠各注射組間的胚胎丟失率無顯著差異，但相同注射時間的初產(chǎn)孕鼠的胚胎丟失率較經(jīng)產(chǎn)組低，并且孕14d注射的經(jīng)產(chǎn)組和初產(chǎn)組間有顯著性差異(P<0.05)(見表2)。

4 討論

Burnet提出，體內(nèi)存在為數(shù)眾多具有免疫活性的細胞克隆，每一個克隆細胞都具有其特異的、能與其相應(yīng)抗原決定簇起反應(yīng)的受體。在胚胎時期體細胞突變頻繁，體內(nèi)已具有針對多種抗原的、眾多特異性淋巴細胞克隆，此時若與某種自身的或人工導(dǎo)入的抗原相遇，與其相應(yīng)的淋巴細胞克隆即被破壞或抑制，出生后即對胚胎期曾接觸過的抗原形成耐受，即獲得性免疫耐受，而對胚胎時期從未接觸過的抗原仍產(chǎn)生免疫應(yīng)答。研究表明，采用子宮內(nèi)注射異體、甚至異種細胞的方法，可成功地誘導(dǎo)免疫耐受[1-2]并在移植排斥研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3]。且子宮內(nèi)注射誘導(dǎo)移植耐受還具有所需外源性細胞相對較少、母體內(nèi)環(huán)境可防止微生物侵襲等優(yōu)點。據(jù)此我們認為：采用人源細胞進行子宮內(nèi)注射預(yù)處理，誘導(dǎo)胎鼠對人腫瘤抗原產(chǎn)生特異性免疫耐受，即讓胎鼠的免疫系統(tǒng)將人腫瘤抗原認為是自身抗原，則出生后的小鼠會將具有相同抗原特異性的人腫瘤細胞認為是自身的組織細胞，使之順利在其體內(nèi)成瘤，同時不會影響自身免疫系統(tǒng)對其它免疫活性物質(zhì)的免疫反應(yīng)，從而解決正常動物對異種腫瘤的免疫排斥難題。

注:A： 微量注射針的制備；B：下腹部做縱向切口；C：用棉簽將妊娠子宮從切口中牽出，確保看到所有胎鼠；D：胎鼠腹腔注射；E：縫合筋膜及皮膚

圖1 子宮內(nèi)注射關(guān)鍵步驟

注:與假手術(shù)組比較，**P<0.01。

表2 各組孕鼠妊娠結(jié)局的比較(n=10)

存活乳鼠數(shù)(%)與假手術(shù)組比較，**P<0.01；存活乳鼠數(shù)(%)與初產(chǎn)孕鼠孕14天注射組比較，§P<0.05。

基于上述觀點或假定，我們擬建立昆明小鼠子宮內(nèi)注射方法。在注射部位的選擇上，我們采用了胎鼠腹腔注射。劉英等[4]采用胎鼠腹腔注射成功地建立了人臍血造血干細胞宮內(nèi)移植的小鼠模型，其推測宿主腹腔的間皮細胞可提供支架基質(zhì)作用，使腹腔如同一個造血干細胞庫，不斷地把造血干細胞輸送到血循環(huán)。該原理同樣適用模型建立中擬注射的人腫瘤細胞。在注射時間的選擇上，考慮到過早注射對胎鼠的損傷較大，而越晚注射則誘導(dǎo)的免疫耐受效果越差，因此在保證胎鼠存活率的前提下盡量提前注射時間，確定注射時間范圍在孕14～16d之間，本實驗確定了該時間范圍，注射操作對胎鼠存活率無明顯影響，可作為后續(xù)研究優(yōu)化胎鼠腹腔注射時間的選取范圍。在孕鼠選擇上，實驗結(jié)果表明孕14d注射組經(jīng)產(chǎn)孕鼠較初產(chǎn)孕鼠的胎鼠成活率明顯增加，難產(chǎn)死亡的數(shù)量也有所減少，可能經(jīng)產(chǎn)孕鼠的生育耐受性、適應(yīng)性和經(jīng)驗上都優(yōu)于初產(chǎn)孕鼠，因此采用經(jīng)產(chǎn)孕鼠可顯著提高子宮內(nèi)注射后胎鼠存活率，后續(xù)研究將采用經(jīng)產(chǎn)孕鼠。

在子宮內(nèi)注射后出現(xiàn)的流產(chǎn)和早產(chǎn)與操作技術(shù)密切相關(guān)，主要是術(shù)中對胚胎操作的過度壓迫、子宮復(fù)位不佳和手術(shù)時間過長造成的。為減少并發(fā)癥的發(fā)生，我們采取了以下措施：①采用玻璃毛細胞拉制針頭，使進針損傷降至最低，羊水不易漏出。②進針時盡量避開血管和胎盤，動作輕柔，以減少出血的發(fā)生。③經(jīng)胎鼠腹腔途徑時，調(diào)整胎鼠位置，使其充分暴露腹部后再進針，以減少對胎鼠的損傷。④術(shù)后給與鎮(zhèn)痛藥，減少孕鼠的不適。⑤整個手術(shù)過程嚴格無菌操作，加強術(shù)后的保暖和護理措施。實驗操作技術(shù)的提高和熟練可明顯降低流產(chǎn)、早產(chǎn)和機械性損傷的發(fā)生。

通過以上實驗，我們確認了后續(xù)研究中的關(guān)鍵因素，優(yōu)化、改進了操作技術(shù)，有助于研究的順利進行。

[1]Jeng Chang Chen, Liang Shi Ou, Hsiu Yueh Yu, et al. Allogeneic lymphocytes exerted graft-versus-host rather than tolerogenic effects on preimmune fetuses[J].J Surg Res, 2013, 183(1): 405-411.

[2]Kristin L MacArthur, Catherine H Wu, George Y Wu. Animal models for the study of hepatitis C virus infection and replication[J].World J Gastroenterol, 2012, 18(23): 2 909-2 913.

[3]Jeng Chang Chen, Ming Ling Kuo, Liang Shiou Ou, et al. Characterization of tolerance induction through prenatal marrow transplantation: the requirement for a threshold level of chimerism to establish rather than maintain postnatal skin tolerance[J].Cell Transplant, 2010, 19(12): 1 609-1 622.

[4]劉英，莊廣倫，游澤山，等. 經(jīng)胎鼠腹腔途徑進行人臍血造血干細胞宮內(nèi)移植的實驗[J].中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001，22(1)：22-24, 28.