陳靜，方拴鋒

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，河南省兒童醫(yī)院(鄭州兒童醫(yī)院) 兒童保健科，河南 鄭州 450000

由于早產(chǎn)兒消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，導(dǎo)致胃腸調(diào)節(jié)能力低下和消化液分泌不足等諸多問題。因此在喂養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)早產(chǎn)兒腹脹、嘔吐、胃潴留等多種癥狀。當(dāng)這些癥狀出現(xiàn)進(jìn)行性加重并伴有喂養(yǎng)障礙時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致新生兒喂養(yǎng)不耐受(feeding intolerance，F(xiàn)I)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)，該疾病是引起新生兒高病死率的主要原因[1]。研究表明，腸道中早期微生物的組成影響了新生兒的諸多生理功能，包括免疫防御、血管再生、感覺-運(yùn)動(dòng)功能、屏障功能、腸道營(yíng)養(yǎng)和激素分泌等[2]。因此，早產(chǎn)兒FI發(fā)病可能與異常菌群在腸道定植有著密切的關(guān)系[3]。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)分析和比較FI早產(chǎn)兒和早產(chǎn)兒腸道微生物的差異，從微生態(tài)學(xué)的角度分析早產(chǎn)兒FI發(fā)病的可能機(jī)制，為臨床醫(yī)生認(rèn)識(shí)早產(chǎn)兒FI以及為治療早產(chǎn)兒FI提供新思路。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2016年3月至2017年3月在我院兒科新生兒病房收治的30例FI早產(chǎn)兒為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕周32～37周，出生體重<2 500 g，經(jīng)剖宮產(chǎn)娩出，以配方奶喂養(yǎng)，出生時(shí)無臍繞頸、無窒息以及羊水污染史，生后24 h內(nèi)收住新生兒科；(2)FI診斷標(biāo)準(zhǔn)：早產(chǎn)兒無法消化腸內(nèi)食物，鼻飼下胃內(nèi)殘余量超過喂入量的50%，伴有腹脹、嘔吐或兩者兼有[3]；(3)母親健康狀況：1為健康、0為不健康。排除標(biāo)準(zhǔn)：有消化系統(tǒng)先天畸形者、NEC、膿毒癥及抗生素、益生菌使用者。對(duì)照組選取同時(shí)間段與FI組的胎齡、納入分組時(shí)的日齡、體重等相匹配未發(fā)生FI的10例早產(chǎn)兒。采集出現(xiàn)FI時(shí)和同時(shí)間段對(duì)照組的早產(chǎn)兒的糞便標(biāo)本，用無菌EP管收集，干冰送至實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑及儀器 使用天根細(xì)菌總DNA提取試劑盒(天根生化科技，北京)提取糞便樣本中總細(xì)菌DNA。Real-time PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)，引物序列見表1。引物和SYBR premix Ex TaqTM購(gòu)自寶生物(大連，中國(guó))，實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀為Bio-Rad CFX96 PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)。

1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取健康嬰兒糞便基因組DNA，用細(xì)菌引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，測(cè)定純化產(chǎn)物的吸光度值和濃度，換算為各樣本標(biāo)準(zhǔn)品1 μL的拷貝數(shù)用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 96孔反應(yīng)板加入總體積為25 μL PCR反應(yīng)液。按下列體系加樣：DNA模板2 μL，PCR上、下游引物各1 μL，SYBR 12.5 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件如下：(1)大腸埃希菌：預(yù)變性95℃ 30 s；變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，循環(huán)數(shù)40。(2)肺炎克雷伯菌和糞腸球菌：分別預(yù)變性95℃ 30 s；變性95℃ 5 s，退火59℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，循環(huán)數(shù)40。(3)雙歧桿菌和乳桿菌：分別預(yù)變性95℃ 10 min；變性95℃ 15 s，退火60 ℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，循環(huán)數(shù)40。

表1 細(xì)菌特異性引物序列

1.5數(shù)據(jù)分析

1.5.1研究對(duì)象臨床特征分析 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5.2熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析 利用2△△Ct方法計(jì)算目的基因與內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)比值，依次反映FI組與對(duì)照組目的基因相對(duì)表達(dá)情況。具體計(jì)算方法如下：求出每個(gè)樣品目的基因和內(nèi)參基因的3個(gè)復(fù)孔Ct值的平均值；△Ct=目的基因-內(nèi)參基因；△△Ct=FI組△Ct-對(duì)照組△Ct；目的基因相對(duì)表達(dá)量=2△△Ct。設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以確定擴(kuò)增的重復(fù)性好，檢驗(yàn)結(jié)果是否可靠，見圖1。

注：A～E分別為大腸埃希菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、乳桿菌(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifidobacteria)的擴(kuò)增曲線。

圖1腸道細(xì)菌熒光實(shí)時(shí)定量PCR重復(fù)性檢驗(yàn)

2 結(jié) 果

2.1臨床特征 表2顯示不同組間的一般臨床特征。在開始喂養(yǎng)的1周內(nèi)，F(xiàn)I組早產(chǎn)兒大多出現(xiàn)以腹脹、嘔吐為主要臨床表現(xiàn)的癥狀，嘔吐物均為未消化奶瓣，每個(gè)早產(chǎn)兒嘔吐次數(shù)≥3次/d。兩組早產(chǎn)兒胎齡、出生體重和性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2目的基因相對(duì)表達(dá)量比較 結(jié)果顯示：FI組早產(chǎn)兒腸道大腸埃希菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)相對(duì)表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(圖2A-B)，糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、乳桿菌(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifidobacteria)表達(dá)明顯低于對(duì)照組(圖3C-E)。

表2 兩組研究對(duì)象臨床特征

注：A～E分別為對(duì)照組與FI組早產(chǎn)兒腸道中腸道大腸埃希菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、乳桿菌(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifidobacteria)的表達(dá)情況，同對(duì)照組比較，aP<0.01。

圖2FI組和對(duì)照組早產(chǎn)兒腸道細(xì)菌的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

3.1結(jié)果分析 在腸道復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)中，微生物群落通過細(xì)菌與宿主、細(xì)菌與細(xì)菌間形成相互制約、相互依賴的腸道微生態(tài)系統(tǒng)，并發(fā)揮著機(jī)體防御、營(yíng)養(yǎng)及免疫調(diào)節(jié)等諸多功能[2,4]。本研究結(jié)果顯示，與相同出生條件的早產(chǎn)兒相比，F(xiàn)I組早產(chǎn)兒腸道中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等有害菌的增加，糞腸球菌、雙歧桿菌和乳桿菌的減少可能導(dǎo)致腸道定植抗力降低，消弱了早產(chǎn)兒機(jī)體抵抗疾病的能力。

大腸埃希菌作為人體胃腸道典型的共生菌，在新生兒生后數(shù)小時(shí)便出現(xiàn)在胃腸道中，通過消耗腸腔中的氧氣，為多種專性厭氧菌的定植創(chuàng)造適宜條件。當(dāng)機(jī)體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境失衡后，大腸埃希菌亦可通過與人體細(xì)胞發(fā)生特異粘附、進(jìn)而定居繁殖和產(chǎn)生腸毒素發(fā)揮致病作用。在本研究當(dāng)中，Real-time PCR結(jié)果顯示了早產(chǎn)兒糞便樣本中FI組的大腸埃希菌相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，提示了早產(chǎn)兒胃腸道中異常增加的大腸埃希菌可能是FI的致病危險(xiǎn)因素之一。其具體的原因和機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步的研究。

肺炎克雷伯菌作為人類消化道條件致病菌之一，當(dāng)機(jī)體抵抗力低下時(shí)，極易在腸道中定植并繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致腸炎[5]。由于早產(chǎn)兒免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，經(jīng)常使用侵入性醫(yī)療操作或使用抗生素治療，極易引發(fā)肺炎克雷伯菌感染[6]。Real-time PCR結(jié)果顯示，早產(chǎn)兒糞便樣本中FI組的肺炎克雷伯菌明顯高于對(duì)照組早產(chǎn)兒。因此，肺炎克雷伯菌可能參與了早產(chǎn)兒FI的發(fā)病過程。

腸球菌屬的糞腸球菌，可通過自身代謝產(chǎn)物與其他腸道菌群一起調(diào)整機(jī)體微生態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡[7]。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究已經(jīng)報(bào)道了糞腸球菌可通過與腸上皮細(xì)胞相互作用，減輕宿主的炎癥反應(yīng)，為腸道疾病提供保護(hù)作用[8]。在本研究當(dāng)中，Real-time PCR結(jié)果顯示FI早產(chǎn)兒糞便樣本中糞腸球菌數(shù)量低于對(duì)照組早產(chǎn)兒，其具體作用和機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

乳桿菌作為腸道益生菌，可通過產(chǎn)生乳酸、細(xì)菌素以及過氧化氫等抗菌物質(zhì)抑制腸道有害菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而起到保護(hù)腸道的作用[9]。研究證實(shí)，早產(chǎn)兒腸道乳桿菌定植時(shí)間要比足月新生兒晚[10]，而且數(shù)量也明顯偏低[11]。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，乳桿菌等益生菌對(duì)早產(chǎn)兒腸道各功能的發(fā)育、發(fā)展及成熟起到了重要的保護(hù)作用[12]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)I早產(chǎn)兒糞便樣本中乳桿菌數(shù)量低于健康早產(chǎn)兒。提示了腸道乳桿菌有益菌的減少減弱了益生菌的保護(hù)性作用，極易遭受致病細(xì)菌的攻擊，使得早產(chǎn)兒FI發(fā)生的幾率大大提高。

同樣作為腸道益生菌的雙歧桿菌在腸道免疫功能上也起到了舉足輕重的作用。新生兒出生后5～6 h腸道內(nèi)就有雙歧桿菌定植，1～2周后成為腸道的優(yōu)勢(shì)種群。雙歧桿菌與新生兒腸道功能、免疫功能和營(yíng)養(yǎng)代謝密切相關(guān)，是保證兒童正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需[13]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)I早產(chǎn)兒糞便樣本中雙歧桿菌數(shù)量要明顯低于健康早產(chǎn)兒。提示了雙歧桿菌可能同糞腸球菌和乳桿菌一樣是FI早產(chǎn)兒的保護(hù)因素。

3.2同類研究的比較以及不足之處 與其他研究相比，本研究利用Realt-ime PCR技術(shù)檢測(cè)早產(chǎn)兒糞便樣本中的菌群變化。發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒糞便樣本中FI組的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，然而糞腸球菌、雙歧桿菌和乳桿菌卻明顯低于對(duì)照組。相比于其他同類型的研究，利用Real-time PCR能快速準(zhǔn)確的鑒定出FI早產(chǎn)兒胃腸道菌群的變化，而FI和這5種細(xì)菌之間的因果關(guān)系有待于深入研究?？紤]到機(jī)體微生態(tài)是一個(gè)復(fù)雜的情況，該研究?jī)H選擇了具有代表性的菌類進(jìn)行研究，其他的菌類尚未涉及。因此，在以后的研究中可擴(kuò)大研究的菌群數(shù)量，為以后臨床應(yīng)用提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

3.3研究的意義 除了由于早產(chǎn)兒自身腸胃功能不成熟所導(dǎo)致FI的原因之外，胃腸道微生態(tài)失衡也是導(dǎo)致早產(chǎn)兒FI的誘因之一。本研究的結(jié)果揭示了早產(chǎn)兒FI與腸道菌群失衡的關(guān)系，為臨床上認(rèn)識(shí)的發(fā)生機(jī)制和治療提供新的思路。

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