李國林，李 超，李 峰

(銅川礦務(wù)局中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 銅川 727000)

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤之一，每年發(fā)病率約為5/10萬[1]。雖然腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率并不高，卻是世界上最致命的癌癥之一，約占癌癥相關(guān)死亡總數(shù)的7%。目前，腦膠質(zhì)瘤的治療方法包括手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療，但膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后依然不容樂觀，特別是對于高級別膠質(zhì)瘤患者。腫瘤分級、分化程度和患者年齡很大程度決定著腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后，然而，病情類似的患者的預(yù)后仍存在顯著差異[2]。因此，臨床上迫切需要篩選新的分子生物標(biāo)志物，以指導(dǎo)膠質(zhì)瘤的個體化治療和預(yù)后評估[3]。端粒是位于染色體末端的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，具有保護(hù)和維持遺傳完整性和穩(wěn)定性的作用。OBFC1蛋白是人端粒結(jié)合蛋白CST復(fù)合物的一部分，其與端粒3′端結(jié)合并在維持端粒穩(wěn)定性中起重要作用[4]。目前，OBFC1基因多態(tài)性與中風(fēng)[5]、結(jié)直腸癌[6]的相關(guān)性已有報道。本研究旨在探討OBFC1基因上rs9325507、rs3814220、rs12765878和rs11191865等4個位點的多態(tài)性與腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2012年1月至2016年12月銅川礦務(wù)局中心醫(yī)院收治的腦膠質(zhì)瘤患者，入選條件：(1)原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者，符合腦膠質(zhì)瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)未經(jīng)過手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療等任何治療；(2)精神狀況良好；(3)研究對象之間無直接親屬關(guān)系。共納入腦膠質(zhì)瘤患者200例(腦膠質(zhì)瘤組)，男100例，女100例，年齡35～65(48.18±10.53)歲。另選擇同期體檢健康人群200例(對照組)，男100例，女100例，年齡35～65(48.24±12.05)歲；入選條件：(1)既往無腫瘤、慢性疾病、嚴(yán)重代謝性疾病及內(nèi)分泌失調(diào)等；(2)精神狀況良好；(3)甲胎蛋白和癌胚抗原陰性；(4)研究對象之間無直接親屬關(guān)系。2組受試者的性別、年齡構(gòu)成比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已獲得所有受試者的知情同意，簽署知情同意書，符合倫理學(xué)規(guī)定，并通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器全血基因組純化試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，iPLEX Gold 試劑盒(美國Sequenom公司)；MassArray質(zhì)譜儀、MassARRAY RS100軟件(美國Sequenom公司)，GeneAmp 9700聚合酶鏈反應(yīng)儀(美國ABI公司)。

1.3血樣采集及DNA提取采集受試者外周靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，現(xiàn)場編號并登記姓名，所有標(biāo)本采集當(dāng)天送回實驗室，置于-70 ℃ 冰箱保存，以備DNA提取。采用全血DNA純化試劑盒進(jìn)行DNA提取，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4基因分型從NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)和HapMap數(shù)據(jù)庫(ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap/)中查詢OBFC1基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點，選擇在中國人群具有較高頻率的位點(最小等位基因頻率≥5%)，最終確定了rs9325507、rs3814220、rs12765878和rs11191865 4個位點。采用Sequenom MassARRAY SNP基因分型技術(shù)對所選擇的SNP位點進(jìn)行分型。單堿基延伸引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行設(shè)計和合成，反應(yīng)在MassArray質(zhì)譜儀中進(jìn)行，基因分型使用Sequenom MassARRAY RS1000軟件進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算各位點的等位基因及基因型頻數(shù)，2組間各位點的等位基因頻率分布比較采用χ2檢驗；應(yīng)用SNPStats在線軟件(http：//bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm)(西班牙加泰羅尼亞腫瘤研究所)評估各SNP位點基因型與腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險的相關(guān)性[8]，使用Haploview 4.2軟件(美國懷特海德生物醫(yī)學(xué)研究所)進(jìn)行單體型與腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險的相關(guān)性分析，以相對優(yōu)勢比(odds ratio，OR)和95%可信區(qū)間(confidence intervals，CI)表示SNP和單體型與腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險的關(guān)系；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1候選SNP基本信息OBFC1基因上4個候選SNP位點的基本信息見表1。4個位點均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。OBFC1基因上的rs9325507位點的等位基因“T”、rs3814220位點的等位基因“G”、rs12765878位點的等位基因“C”和rs11191865位點的等位基因“A”均可顯著降低腦膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險(P<0.05)。

表1OBFC1基因上4個候選SNP的最小等位基因頻率

Tab.1TheminimumallelefrequencyofthefourcandidateSNPsinOBFC1gene

SNP基因染色體位置等位基因最小等位基因頻率腦膠質(zhì)瘤組對照組HWEPOR95%CI下限上限Prs9325507OBFC110q24．33T/C0．3320．4090．4740．7140．5640．9040．005rs3814220OBFC110q24．33G/A0．3310．4100．4750．7150．5650．9050．005rs12765878OBFC110q24．33C/T0．3330．4110．4740．7140．5640．9140．004rs11191865OBFC110q24．33A/G0．3290．4070．7180．7160．5650．9060．005

2.2候選SNP在遺傳模型下與腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險的相關(guān)性引入遺傳模型，評估風(fēng)險等位基因在4個不同遺傳模型(共顯性、顯性、隱性和加性)下的風(fēng)險，按照性別、年齡修正，結(jié)果顯示見表2、表3、表4和表5。在最佳模型顯性模型下，rs9325507位點攜帶T/C和T/T基因型的個體腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險顯著降低，是攜帶C/C基因型的0.62倍(OR=0.620，95%CI為0.430～0.900，P=0.012)；rs3814220位點攜帶G/A和G/G基因型的個體腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險顯著降低，是攜帶A/A基因型的0.62倍(OR=0.620，95%CI為0.430～0.910，P=0.014)；rs12765878位點攜帶C/T和C/C基因型的個體腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險顯著降低，是攜帶T/T基因型的0.62倍(OR=0.620，95%CI為0.430～0.900，P=0.012)；rs11191865位點攜帶A/G和A/A基因型的個體腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險顯著降低，是攜帶G/G基因型的0.65倍(OR=0.650，95%CI為0.450～0.940，P=0.023)。

表2遺傳模型下rs9325507與腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險的相關(guān)性

Tab.2Correlationbetweenrs9325507andtheriskofgliomaundergeneticmodels

模型基因型對照組/例(%)腦膠質(zhì)瘤組/例(%)OR95%CI下限上限P共顯性C/C68(34．0)91(45．5)1 --T/C101(50．5)86(43．0)0．6100．4100．9100．042T/T31(15．5)23(11．5)0．6400．3601．150顯性C/C68(34．0)91(45．5)1 - -T/C、T/T132(66．0)109(54．5)0．6200．4300．9000．012隱性C/C、T/C169(84．5)177(88．5)1 - -T/T31(15．5)23(11．5)0．8300．4801．4300．510加性---0．7400．5700．9700．031

注：“-”為無此數(shù)據(jù)。

表3遺傳模型下rs3814220與腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險的相關(guān)性

Tab.3Correlationbetweenrs3814220andtheriskofgliomaundergeneticmodels

模型基因型對照組/例(%)腦膠質(zhì)瘤組/例(%)OR95%CI下限上限P共顯性A/A69(34．5)90(45．0)1 --G/A101(50．5)86(43．0)0．6200．4200．9200．048G/G30(15．0)24(12．0)0．6400．3601．150顯性A/A69(34．5)90(45．0)1 - -G/A、G/G131(65．5)110(55．0)0．6200．4300．9100．014隱性A/A、G/A170(85．0)176(88．0)1 - -G/G30(15．0)24(12．0)0．8300．4801．4200．490加性---0．7500．5700．9800．034

注：“-”為無此數(shù)據(jù)。

表4遺傳模型下rs12765878與腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險的相關(guān)性

Tab.4Correlationbetweenrs12765878andtheriskofgliomaundergeneticmodels

模型基因型對照組/例(%)腦膠質(zhì)瘤組/例(%)OR95%CI下限上限P共顯性T/T68(34．0)92(46．0)1 - - C/T100(50．0)86(43．0)0．6100．4100．9100．042C/C32(16．0)22(11．0)0．6400．3601．150顯性T/T68(34．0)92(46．0)1 - -C/T、C/C132(66．0)108(54．0)0．6200．4300．9000．012隱性T/T、C/T168(84．0)178(89．0)1 - -C/C32(16．0)22(11．0)0．8300．4801．4300．510加性---0．7400．5700．9700．031

注：“-”為無此數(shù)據(jù)。

表5遺傳模型下rs11191865與腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險的相關(guān)性

Tab.5Correlationbetweenrs11191865andtheriskofgliomaundergeneticmodels

模型基因型對照組/例(%)腦膠質(zhì)瘤組/例(%)OR95%CI下限上限P共顯性G/G69(34．5)89(44．5)1 --A/G100(50．0)86(43．0)0．6500．4400．9700．075A/A31(15．5)25(12．5)0．6400．3501．140顯性G/G69(34．5)89(44．5)1 - -A/G、A/A131(65．5)111(55．5)0．6500．4500．9400．023隱性G/G、A/G169(84．5)175(87．5)1 - -A/A31(15．5)25(12．5)0．8000．4601．3800．420加性---0．7500．5700．9900．041

注：“-”為無此數(shù)據(jù)。

2.3候選SNP單體型與腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險的相關(guān)性對4個SNP位點進(jìn)行連鎖不平衡分析，并構(gòu)建單體型，結(jié)果顯示，rs9325507、rs3814220、rs12765878和rs11191865等4個位點具有強(qiáng)連鎖關(guān)系，見圖1。進(jìn)一步分析單體型與疾病風(fēng)險的相關(guān)性，結(jié)果顯示，TGCA單體型會顯著降低腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險(OR=0.760，95%CI為0.580～0.990，P=0.044)，見表6。

表6OBFC1基因候選SNP的單體型與腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險的相關(guān)性

Tab.6CorrelationbetweenhaplotypeofSNPinOBFC1geneandtheriskofglioma

rs9325507rs3814220rs12765878rs11191865對照組腦膠質(zhì)瘤組OR95%CI下限上限PCATG0．5900．6681．000---TGCA0．4100．3320．7600．5800．9900．044

注：“-”為無此數(shù)據(jù)。

圖1OBFC1基因上4個候選SNP的連鎖不平衡圖

Fig.1LinkagedisequilibriumdiagramofthefourcandidateSNPsinOBFC1gene

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是一種復(fù)雜疾病，由遺傳因素和環(huán)境因素共同決定其發(fā)生、發(fā)展。目前，全基因組關(guān)聯(lián)分析研究已鑒定出許多與腦膠質(zhì)瘤相關(guān)的基因和位點，但這仍不足以完全揭示其遺傳因素?？蒲泄ぷ髡呷灾铝τ诎l(fā)現(xiàn)更多的腦膠質(zhì)瘤遺傳易感位點。

OBFC1和C17ORF68是α輔助因子的亞基，可以刺激DNA聚合酶-α-引發(fā)酶，從而啟動DNA復(fù)制的酶的活性。同時，OBFC1也在與C17ORF68和TEN1的端粒相關(guān)復(fù)合物中起生物學(xué)作用[9]。隨后，全基因組關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)，OBFC1基因的多態(tài)性與人類端粒長度具有相關(guān)性，而端粒長度一直以來與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10]。OBFC1基因位于染色體10q24.33區(qū)域，最早被發(fā)現(xiàn)與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的患病風(fēng)險具有相關(guān)性。在一項包含1 148例冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者、566例2型糖尿病患者和765例健康者的關(guān)聯(lián)研究中，研究者檢測了OBFC1基因rs10786775和rs11591710等2個位點的多態(tài)性，結(jié)果顯示，rs10786775位點的最小等位基因G與較長的端粒長度具有相關(guān)性，并且由rs10786775和 rs11591710位點的最小等位基因G和C組成的單體型與降低冠狀動脈粥樣硬化性心臟病風(fēng)險具有相關(guān)性[11]。然而，在一項關(guān)于OBFC1基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)研究中，研究者分別檢測了400例患者和399例健康者OBFC1基因上5個位點的多態(tài)性，結(jié)果顯示，沒有1個位點與缺血性腦卒中患病風(fēng)險相關(guān)[5]。LI等[6]對OBFC1基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性進(jìn)行了研究，但并未報道顯著的位點。本研究發(fā)現(xiàn)，在OBFC1基因上的4個SNP位點與腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險相關(guān)；在所挑選的4個SNP位點中，rs3814220和rs12765878的多態(tài)性已被確認(rèn)與端粒長度具有相關(guān)性[10]；rs11191865是高加索人群中特發(fā)性間質(zhì)性肺炎和系統(tǒng)性硬化癥的共享風(fēng)險位點[12]，而有關(guān)于rs9325507位點的文獻(xiàn)很少。本研究結(jié)果顯示，rs9325507位點的等位基因“T”、rs3814220位點的等位基因“G”、rs12765878位點的等位基因“C”和rs11191865位點的等位基因“A”均會顯著降低腦膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險。但是，由于本研究樣本量較小，因此該結(jié)果仍需在更大的樣本人群中進(jìn)一步驗證。

綜上所述，本研究共挑選了4個位于OBFC1基因上的SNP位點并檢測其多態(tài)性，研究發(fā)現(xiàn)rs9325507、rs3814220、rs12765878和rs11191865 4個位點與降低腦膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險具有相關(guān)性。這為腦膠質(zhì)瘤的早期診斷與預(yù)防提供了新的候選基因位點，也為后續(xù)深入研究腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，后續(xù)研究會基于動物模型和功能實驗進(jìn)一步驗證這些多態(tài)性位點在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。

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