江成英 ， 王 松 ， 張文學(xué) ， 韓國棟 ， 郭宏文 ， 韓 穎 ， 祝露露

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006）

玉米蛋白粉也稱為玉米麩質(zhì)粉，是加工玉米淀粉的副產(chǎn)物之一，主要成分為玉米醇溶蛋白和玉米黃色素（趙文揚(yáng)等，2015），其中醇溶蛋白的含量可高達(dá)45%，而水溶性蛋白僅占3%左右，因而玉米蛋白粉水溶性特別差，且所含蛋白質(zhì)缺少賴氨酸、色氨酸等必需氨基酸，所以其生物學(xué)價(jià)值低（Shukla，2001），將其用于飼料工業(yè)，存在蛋白質(zhì)消化利用率低的問題。采用微生物發(fā)酵的方法可提高玉米蛋白的可溶性，從而提高其作為飼料的動(dòng)物消化利用率，促進(jìn)玉米蛋白質(zhì)資源的有效利用（王燕等，2014）。

生產(chǎn)微生物發(fā)酵飼料的首要問題是選擇合適的菌種。目前微生物發(fā)酵飼料最常使用的菌種為酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌、鏈球菌屬及部分霉菌等（劉艷新，2017）。本研究以發(fā)酵飼料中可溶性蛋白為指標(biāo)，篩選出酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌的三菌組合用來生產(chǎn)玉米蛋白粉發(fā)酵飼料。

1 材料與方法

1.1 主要材料及設(shè)備 菌種：熱帶假絲酵母、啤酒酵母、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜酸乳酸桿菌、嗜熱乳酸桿菌均由齊齊哈爾大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。

原料：玉米蛋白粉、麩皮均為市售。

試劑：葡萄糖、胰蛋白胨、酵母浸出物、氯化鈉、牛肉膏、瓊脂、磷酸氫二鉀、檸檬酸二銨、醋酸鈉、吐溫 80、七水合硫酸鎂、四水合硫酸錳、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、三氯乙酸等均為國產(chǎn)分析純。

設(shè)備：電熱恒溫培養(yǎng)箱 （上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），PHS-25數(shù)顯pH計(jì) （上海精密科學(xué)儀器有限公司），超凈工作臺（上海智城分析儀器有限公司），BS224S型電子天平（北京塞多利斯儀器廠），手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），紫外可見分光光度計(jì)（日本島津儀器廠）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 篩選培養(yǎng)基：5 g玉米蛋白粉、pH中性，2 g瓊脂，定容至100 mL，121℃蒸汽滅菌；發(fā)酵培養(yǎng)基：35 g玉米蛋白粉、15 g麩皮、50 g水，pH中性，121℃蒸汽滅菌；PDA培養(yǎng)基：取約200 g的馬鈴薯，去外皮后切成較碎小塊，煮沸約40 min后進(jìn)行過濾，將濾液配成1000 mL的溶液，葡萄糖20 g，pH自然，固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂；NA培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉3.0 g、氯化鈉5.0 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.3，固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂；MRS乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母膏 5.0 g、檸檬酸氫二銨 2.0 g、葡萄糖 20.0 g、吐溫 80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀 2.0 g、硫酸鎂 0.58 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂 18.0 g、蒸餾水 1000 mL，pH 6.5，固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂。

1.2.2 菌種活化 在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)對已配制的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，分別將熱帶假絲酵母、啤酒酵母接種到PDA培養(yǎng)基，凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌接種到NA培養(yǎng)基，嗜酸乳酸桿菌、嗜熱乳酸桿菌接種到MRS乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱內(nèi)30℃下培養(yǎng)48 h備用。

1.2.3 平板培養(yǎng) 首先確定菌種是否對玉米黃粉具有利用能力。將活化好的八株菌在篩選培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，每菌三個(gè)平行，在30℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h，觀察各菌種的生長情況。

1.2.4 發(fā)酵試驗(yàn) 將能利用玉米蛋白粉的菌種活化后接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，置于30℃條件下發(fā)酵一定時(shí)間，測定其可溶性蛋白含量。

1.2.5 正交試驗(yàn) 以篩選出的三種菌株另加一空列為因素，接種量為水平，設(shè)計(jì)四因素三水平（L934）的正交試驗(yàn)。三種菌株分別活化后，按一定比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃發(fā)酵144 h，根據(jù)所測定的發(fā)酵玉米蛋白粉飼料中可溶性蛋白含量，對配合菌株的接種比例進(jìn)行確定。

1.2.6 主要測定方法 可溶性蛋白含量的測定采用福林酚法（王永華，2010）。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種利用玉米蛋白粉能力測定 將待選的八種菌株分別在含有5%玉米蛋白粉的篩選固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，根據(jù)其生長狀況確定其對玉米蛋白粉的利用能力。結(jié)果表明，本研究所采用發(fā)酵飼料常用的八種菌種在篩選培養(yǎng)基上均長勢良好，說明都具有較強(qiáng)的利用玉米蛋白粉的能力，故這八種待選菌株均可作為發(fā)酵玉米蛋白粉發(fā)酵菌種。

2.2 發(fā)酵用配合菌株的選擇 由于所選用的八種菌株均能利用玉米蛋白粉，故都用于發(fā)酵用配合菌株的篩選。將其分別活化后，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)。每24 h取樣測定其中的可溶性蛋白含量，以確定各種菌株發(fā)酵玉米蛋白粉的能力。結(jié)果見表1。

表1 各菌種發(fā)酵玉米蛋白粉的可溶性蛋含量%

據(jù)表1可以看出，所選用的八種菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基后，隨著時(shí)間的延長，發(fā)酵飼料中的可溶性蛋白含量均逐步提高。其中芽孢桿菌中枯草芽孢桿菌發(fā)酵的效果最好，在144 h時(shí)可溶性蛋白含量為10.44%；酵母菌中熱帶假絲酵母菌發(fā)酵的結(jié)果較好，在144 h時(shí)可溶性蛋白含量為9.48%；乳酸桿菌中嗜熱乳酸桿菌發(fā)酵的結(jié)果最好，在144 h時(shí)可溶性蛋白含量為9.04%。

目前微生物發(fā)酵飼料最常使用的菌種為酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌、鏈球菌屬及部分霉菌等，飼料酵母可產(chǎn)多種動(dòng)物所需的消化酶，對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收起著重要作用，同時(shí)酵母菌具有濃烈的酵母香味，對家畜增加食欲、增強(qiáng)消化吸收等有一定作用（Puniya，2015）；芽孢桿菌具有較強(qiáng)的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性，可明顯提高飼料利用率，還可以消耗大量的氧氣，維持腸道厭氧環(huán)境，抑制致病菌的生長，維持腸道正常生態(tài)平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力（李春鳳，2013）；乳酸菌可以提高飼料的品質(zhì)，并能直接促進(jìn)動(dòng)物生長，改善消化道微生態(tài)環(huán)境，調(diào)節(jié)消化道免疫系統(tǒng)，具有替代含抗生素飼料的潛能（王芳芳，2016）。每種菌在發(fā)酵飼料中都有不同的功效，因此混合發(fā)酵效果要優(yōu)于單菌發(fā)酵。

綜上所述，選擇枯草芽孢桿菌、熱帶假絲酵母和嗜熱乳酸桿菌做為發(fā)酵玉米蛋白粉飼料的配合菌株。

2.3 配合菌株比例的確定 將所選出的三種配合菌株進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定菌種的最佳比例。結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

由表 2 分析可知，RB＞RC＞RA，即因素的主次順序依次為枯草芽孢桿菌（因素B），熱帶假絲酵母菌（因素C），嗜熱乳酸桿菌（因素A）；各因素水平的比較：KB3＞KB2＞KB1，KC2＞KC1＞KC3，KA3＞KA1＞KA2，由此得出利用枯草芽孢桿菌、熱帶假絲酵母和嗜熱乳酸桿菌發(fā)酵玉米蛋白粉飼料的最佳接種比例組合為A3B3C2，即嗜熱乳酸桿菌：枯草芽孢桿菌：熱帶假絲酵母菌=3∶3∶2，通過驗(yàn)證試驗(yàn)，在此接種比例下，發(fā)酵玉米蛋白粉中可溶性蛋白含量達(dá)到最高為14.47%，較發(fā)酵之前的3.04%提高了11.43%。

3 結(jié)論

通過平板培養(yǎng)和發(fā)酵試驗(yàn)相結(jié)合的方法，篩選出以玉米蛋白粉為主要原料生產(chǎn)發(fā)酵飼料的菌種為嗜熱乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母；利用正交試驗(yàn)確定所用三種菌株的比例為嗜熱乳酸桿菌：枯草芽孢桿菌：熱帶假絲酵母=3∶3∶2。

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