付晶鑫

（盤錦市中心血站檢驗科，遼寧 盤錦 124000）

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗（ELISA）是一種常用的固相免疫測定方法，在各種抗原及抗體檢測中都有廣泛的應(yīng)用。2009年修訂版《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》中要求：在進(jìn)行抗體檢測時，首先用高敏感性ELISA法檢測，出現(xiàn)陰性反應(yīng)則報告為HIV抗體陰性，出現(xiàn)陽性反應(yīng)則使用高特異性ELISA試劑進(jìn)行復(fù)檢。目前，在基層HIV抗體初篩實(shí)驗中ELISA法被普遍運(yùn)用，但該檢測方法受多種因素影響，分析ELISA法檢測HIV抗體的影響因素并實(shí)施有針對性的質(zhì)量控制措施十分必要[1-2]。本次研究選取進(jìn)行HIV抗體陽性檢驗的2500例標(biāo)本行ELISA法檢測，將初篩試驗中的5例（0.2%）陽性標(biāo)本送至市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗室予以確認(rèn)，分析整個ELISA法檢測過程，從標(biāo)本來源、試劑、樣本、操作過程著手，提出有效質(zhì)量控制措施。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源：收集2017年1～6月進(jìn)行HIV抗體陽性檢驗的2500例血液標(biāo)本行ELISA法檢測。

1.2 儀器和試劑：使用芬蘭雷勃MK3酶標(biāo)儀、TECAN洗板機(jī)以及移液器。試劑為人類免疫缺陷病毒（HIV）1+2型抗體診斷試劑盒酶聯(lián)免疫雙抗原夾心法，試劑由珠海麗珠試劑股份有限公司提供，生產(chǎn)批號：國藥準(zhǔn)字S20120018。

表1 （HIV）1+2型抗體診斷質(zhì)控結(jié)果

1.3 檢測方法：ELISA檢測嚴(yán)格按照操作說明和《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》要求進(jìn)行，并判斷結(jié)果，采用雙波長450 nm/630 nm，臨界值為cut off=0.1+N（陰性對照均值），標(biāo)本A值＜cut off值則判定為陰性，≥cut off值則判定為陽性；當(dāng)陰性對照A值＜0.02，則按0.02進(jìn)行計算；陽性對照A值＜0.5，陰性對照A值＞0.1，則實(shí)驗失敗[3]。血液標(biāo)本均分別連續(xù)進(jìn)行4次測定。

2 結(jié) 果

2.1 檢測結(jié)果：2500例血液標(biāo)本行ELISA法檢測，將初篩試驗中的5例（0.2%）陽性標(biāo)本送至市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗室予以確定，經(jīng)確定只有1例（0.04%）被確定為HIV抗體陽性，其余為陰性，初篩試驗陽性準(zhǔn)確率為20.00%。（HIV）1+2型抗體診斷質(zhì)控結(jié)果見表1。血液樣本ELISA法檢測HIV抗體4次結(jié)果見表2。

表2 血液樣本ELISA法檢測HIV抗體4次結(jié)果

2.2 ELISA法檢測HIV抗體影響因素：經(jīng)追溯分析發(fā)現(xiàn)，在ELISA法檢測HIV抗體的整個過程中影響因素涉及到各個環(huán)節(jié)，主要有：標(biāo)本、試劑、溫度、人員操作技術(shù)等諸多因素。4例假陽性標(biāo)本中，1例為血液標(biāo)本處理不當(dāng)，受到高濃度非特異性免疫球蛋白的影響，導(dǎo)致假陽性；2例標(biāo)本發(fā)生溶血，1例標(biāo)本被污染。

3 討 論

ELISA法檢測HIV抗體影響因素涉及各個環(huán)節(jié)，主要包括有標(biāo)本、試劑、溫度、人員操作技術(shù)等諸多因素，針對影響因素制定有針對性的控制措施是減少和避免假陽性的關(guān)鍵。

3.1 標(biāo)本內(nèi)源性及外源性干擾和處理：內(nèi)源性干擾因素包括了補(bǔ)體、類風(fēng)濕因子、高濃度非特異性免疫球蛋白等，這些因素往往會造成檢驗結(jié)果的假陽性或者假陰性，解決措施為：對標(biāo)本應(yīng)用0.01 mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行1∶1稀釋，并于溫度56 ℃下進(jìn)行血清滅活（30 min）[4]。外源性干擾因素包括有血液標(biāo)本采集、保存和運(yùn)送等環(huán)節(jié)操作不當(dāng)所造成的標(biāo)本溶血、污染、長時間貯存、加入抗凝物質(zhì)等，解決措施有：①標(biāo)本采集過程中要盡可能防止溶血；②標(biāo)本采集后，于室溫自然放置1～2 h，等血塊收縮、凝固后離心，并將血清吸出；③對血清標(biāo)本立即檢測，標(biāo)本無法立即檢測的要置于4 ℃保存，若放置時間需要1周以上的則將標(biāo)本置于-20 ℃保存；④在加入抗凝物質(zhì)到標(biāo)本中時，盡可能不使用酶抑制劑，避免ELISA中的酶活性降低[5]。

3.2 試劑：①試劑的選擇：ELISA法進(jìn)行HIV抗體檢測的試劑盒必須經(jīng)過注冊批準(zhǔn)，并且檢驗合格，在有效期內(nèi)。在試劑盒選擇時要根據(jù)鑒定報告、臨床評估結(jié)果、室間質(zhì)評評估結(jié)果，選擇高靈敏性、高特異性的試劑。②預(yù)處理：檢測時要做好對試劑的預(yù)處理，這往往是檢驗人員比較容易忽略的步驟，在每一次實(shí)驗之前要從冰箱將試劑盒拿出并在室溫放置平衡約30 min，確保使用之前，試劑的溫度與室溫基本一致，進(jìn)而避免對抗原抗體結(jié)合和反應(yīng)速度造成影響[6]。③確保試劑盒對照質(zhì)控品的有效性：內(nèi)部對照只能在同批號試劑盒中使用，如果無效，則需要重新實(shí)驗。

3.3 儀器及操作：①加樣：在HIV抗體的檢測中必須嚴(yán)格按照《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》操作，避免交叉污染的發(fā)生，操作人員穿好工作衣，戴好手套，嚴(yán)格消毒隔離。在加樣時正確使用移液器（定期校正）加入規(guī)定的量于孔內(nèi)，注意不要加樣到孔壁的邊緣位置，吸頭避免碰到包被的抗原，加樣要做到慢吸快放（避免氣泡和濺出）。在每次加樣后更換吸頭，杜絕交叉污染。試劑滴加時先搖勻滴瓶并將第一滴擠去再滴加，注意不要產(chǎn)生氣泡。②溫度：在ELISA法檢測中，溫度是一個重要的問題，對實(shí)驗成敗起著決定性的作用，因此要控制好溫度。首先是設(shè)置好恒溫箱的溫度，不僅要確定恒溫箱面板顯示的溫度，為了避免實(shí)際溫差，需要在箱內(nèi)使用溫度計，觀察準(zhǔn)確的溫度。然后要確保抗原抗體在設(shè)定溫度下反應(yīng)足夠的時間，最適反應(yīng)溫度為37 ℃，需要經(jīng)過一定時間方可達(dá)到平衡點(diǎn)[7]，因此溫育通常采用的是水育法，溫育時水要處于板條1/3的位置，為了確保溫度平衡一致，因此板條不能疊加放置。③洗板：待檢測血清標(biāo)本中可能存在HIV病毒，為了保證檢驗人員的安全并防止環(huán)境污染，在檢測HIV抗體時要盡可能的用洗板機(jī)洗板，采用ELISA法檢測HIV抗體過程中，洗板是一個十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，對檢驗結(jié)果有直接的影響。根據(jù)說明書的要求對浸泡時間和洗滌次數(shù)進(jìn)行設(shè)置，并在完成洗滌后拍板，并對管道用蒸餾水沖洗防止堵塞；各種試劑盒的洗滌液避免混用；在使用不同廠家酶標(biāo)板時要對吸液頭高度進(jìn)行調(diào)整，避免在酶標(biāo)板中卡住；及時更換有破損的吸液針頭。

3.4 顯示與結(jié)果觀察：嚴(yán)格按照規(guī)定的時間、溫度、反應(yīng)終止，并在顯色反應(yīng)終止后立即使用酶標(biāo)儀比色，在15 min內(nèi)完成判讀。

3.5 復(fù)檢和質(zhì)控：在復(fù)檢時要使用原試劑與另一廠家不同原理的試劑，檢驗結(jié)果HIV抗體為陽性或者一陰一陽則送至艾滋病確證實(shí)驗室確證，若均為陰性則報告HIV抗體陰性。質(zhì)控可采用“即刻法”[8]，即同一質(zhì)控血清連續(xù)測定3次后對最后一次結(jié)果質(zhì)控，一旦實(shí)驗數(shù)據(jù)處于警告、失控狀態(tài)則要立即找出原因，對實(shí)驗的各個環(huán)節(jié)進(jìn)行追溯分析，針對性的解決問題。

綜上所述，在ELISA法檢測HIV抗體的初篩試驗中，要消除操作中的各種影響因素，進(jìn)而有效地避免篩查中的假陽性或者假陰性，保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[1]黃雁,陳興智.HI實(shí)驗室檢驗技術(shù)及效果分析進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥指南,2012,10(3):51-53.

[2]孫愛琴.ELISA法檢測HIV抗體的影響因素和控制措施[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2012,23(4):270-272.

[3]張杰.影響ELISA法檢測HIV抗體準(zhǔn)確性的若干因素和質(zhì)控研究[J].臨床醫(yī)學(xué)研究與實(shí)踐,2016,1(16):119.

[4]胡伯勝. ELISA法檢測HIV抗體質(zhì)量控制方法的應(yīng)用比較[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(24):3391-3392.

[5]王永.探討ELISA法在HIV抗體檢測中的危險因素分析[J].中國保健營養(yǎng),2015,25(15):379-380.

[6]李志明.ELISA法檢測HIV抗體影響因素分析[J].中外醫(yī)療,2011,30(5):191-192.

[7]喬健健.直接ELISA法與間接ELISA法檢測HIV抗體的對比分析[J].中國實(shí)用醫(yī)藥,2012,7(21):111-112.

[8]王雪梅,李代渝,江靈,等.溶血對ELISA與化學(xué)發(fā)光免疫檢測HIV抗體的影響[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2014,29(2):94-96.