支曉陽(yáng) 畢文姿 吳慶 李佳慧 董通雨 張藝之 董郭楓 周鐵麗

肺炎克雷伯菌是造成醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌，可引起人體多部位感染[1]。隨著抗菌藥物的廣泛使用甚至濫用，多重耐藥和廣泛耐藥肺炎克雷伯菌檢出率不斷增加，尤其對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥菌株的大量出現(xiàn)，使臨床抗感染治療面臨“束手無策”的局面[2]。復(fù)方新諾明為甲氧芐啶和磺胺甲惡唑的復(fù)方制劑，對(duì)多種革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌具有協(xié)同抑菌、殺菌作用，且對(duì)多重耐藥菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染具有良好的治療效果[3]。研究表明，肺炎克雷伯菌臨床分離株對(duì)復(fù)方新諾明的逐年耐藥率較平穩(wěn)，且耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對(duì)復(fù)方新諾明仍保持一定程度的敏感性[4]。整合子是多種抗菌藥物耐藥基因水平傳播的重要因素，可捕獲、重排和表達(dá)耐藥基因，與復(fù)方新諾明等多種抗菌藥物的耐藥性相關(guān)[5]。目前尚缺乏關(guān)于肺炎克雷伯菌內(nèi)整合子分布及其與耐藥表型相關(guān)性的系統(tǒng)研究。為探究肺炎克雷伯菌對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥性、臨床菌株內(nèi)整合子分布及其與耐藥表型的相關(guān)性，筆者對(duì)812株臨床分離肺炎克雷伯菌進(jìn)行分析，為臨床耐藥基因的水平傳播、耐藥菌株的控制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集2013年1月至2015年5月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離的812株肺炎克雷伯菌，剔除了同一例患者相同部位分離的重復(fù)菌株。所有菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀鑒定。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853，購(gòu)自衛(wèi)生部臨檢中心。

1.2 儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀（法國(guó)生物梅里埃公司）；S－100TMThermal Cycler PCR儀（美國(guó)BIO－RAD公司）；Bio－Rad凝膠電泳成像分析儀（美國(guó)BIO－RAD公司）；Thermo FRESCO21型離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher有限公司）；DR100型比濁儀（法國(guó)Biomerieux有限公司）；DYY－5穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；PCR反應(yīng)試劑盒（日本TaKaRa公司）；PCR引物（上海華大基因科技有限公司）；核酸染料Gelred（索萊寶科技有限公司）；瓊脂糖干粉（法國(guó)Biowest有限公司）。

1.3 菌株純化、鑒定與藥敏試驗(yàn) 參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化。使用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定。按照操作規(guī)程檢測(cè)肺炎克雷伯菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的敏感性。藥敏結(jié)果參照2015年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)被判讀為敏感、中介和耐藥[6]，其中中介和耐藥合并稱為非敏感，其所占比率為非敏感率。

1.4 基因組提取 將細(xì)菌接種至哥倫比亞血平板，置35℃孵箱培養(yǎng)16～18h后，通過煮沸法粗提肺炎克雷伯菌基因組作為PCR反應(yīng)模板，具體步驟如下：取新鮮培養(yǎng)的純菌于含200μl雙蒸水的EP管中充分研磨、混勻和溶解，100℃煮沸15min，并快速置于冰上10min，使其充分變性，12000r/min離心2min，吸取上清液（即菌株DNA基因組）于新的EP管中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 整合子擴(kuò)增檢測(cè) 整合子的PCR擴(kuò)增體系及引物合成參照先前報(bào)道[7]。整合子引物序列和目的產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 5min；變性94℃ 30s，退火 55℃ 30s，延伸 72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，Gelred染色后凝膠成像觀察結(jié)果，陽(yáng)性產(chǎn)物送至上海華大基因科技公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 PCR引物序列及目的產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥性分析 肺炎克雷伯菌臨床分離株對(duì)頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、亞胺培南、厄他培南耐藥率相對(duì)較低，對(duì)其他抗菌藥物3年耐藥率呈逐年遞增趨勢(shì)或趨于平穩(wěn)，但僅對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率呈逐年遞減趨勢(shì)。進(jìn)一步對(duì)115株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌分析發(fā)現(xiàn)，耐亞胺培南（111株）和耐厄他培南（85株）肺炎克雷伯菌對(duì)復(fù)方新諾明耐藥率較低，總體耐藥率分別為13.5%、18.8%。詳見表2～3。

2.2 肺炎克雷伯菌整合子分布情況 812株肺炎克雷伯菌中，302株攜帶Ⅰ型整合子，陽(yáng)性率為37.2%，本研究未檢測(cè)到Ⅱ、Ⅲ型整合子。按照藥敏試驗(yàn)結(jié)果，將肺炎克雷伯菌臨床分離株分為復(fù)方新諾明耐藥組（175株）和復(fù)方新諾明敏感組（637株），復(fù)方新諾明耐藥組的整合子陽(yáng)性率為63.4%（111/175），復(fù)方新諾明敏感組的整合子陽(yáng)性率為30.0%（191/637），復(fù)方新諾明耐藥組的整合子陽(yáng)性率明顯高于敏感組（P＜0.01）。由于樣本量較大，選取其中24株Ⅰ型整合子陽(yáng)性菌株進(jìn)行圖示，其PCR電泳結(jié)果如圖1。

表2 肺炎克雷伯菌對(duì)臨床常用抗生素的逐年耐藥率（%）

表3 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌對(duì)復(fù)方新諾明敏感性分析

圖1 Ⅰ型整合子陽(yáng)性菌株P(guān)CR電泳圖

2.3 整合子陽(yáng)性/陰性菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥性比較 整合子陽(yáng)性菌株組對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢曲松、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的非敏感率均明顯高于整合子陰性菌株組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。詳見圖2。

圖2 肺炎克雷伯菌整合子陽(yáng)性/陰性菌株對(duì)其他抗生素敏感性分析

2.4 不同耐藥表型菌株的整合子分布情況 復(fù)方新諾明耐藥組中，多重耐藥菌株中有92株攜帶Ⅰ型整合子，陽(yáng)性率為73.0%（92/126），廣泛耐藥菌株有20株攜帶Ⅰ型整合子，陽(yáng)性率為100.0%（20/20）；復(fù)方新諾明敏感組中，多重耐藥菌株有93株攜帶Ⅰ型整合子，陽(yáng)性率為53.1%（93/175），低于復(fù)方新諾明耐藥組的多重耐藥菌株，廣泛耐藥菌株有79株攜帶Ⅰ型整合子，陽(yáng)性率為84.9%（79/93），同樣低于復(fù)方新諾明耐藥組的廣泛耐藥菌株，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。詳見表4。

3 討論

肺炎克雷伯菌是引起院內(nèi)感染的常見條件致病菌之一。多重耐藥肺炎克雷伯菌檢出率不斷增高，導(dǎo)致住院患者出現(xiàn)較高的致死率[8]。隨著耐藥基因的水平傳播，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌分離率不斷增高，使臨床抗感染治療更加困難[9]。由于碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌數(shù)量逐年增加，因此臨床亟需尋找其他可替代的抗菌藥物。

表4 復(fù)方新諾明耐藥菌株和敏感菌株內(nèi)IntⅠ整合子攜帶情況

復(fù)方新諾明抗菌譜廣，對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、志賀菌屬等均具有抗菌作用[10]。盡管肺炎克雷伯菌臨床分離株對(duì)復(fù)方新諾明總耐藥率達(dá)21.6%，但筆者分析發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率呈逐年下降趨勢(shì)，這種現(xiàn)象可能與臨床用藥頻度的相對(duì)較低以及抗菌藥物的合理使用有關(guān)[11-12]。Xiao等[13]研究表明產(chǎn)碳青霉烯酶菌株對(duì)復(fù)方新諾明耐藥率高于碳青霉烯酶陰性菌株。而本研究，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌對(duì)復(fù)方新諾明敏感性良好，亞胺培南和厄他培南耐藥菌株對(duì)復(fù)方新諾明總耐藥率分別僅為9.9%、10.2%，提示復(fù)方新諾明可作為耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌感染治療良好的藥物選擇，為臨床抗感染治療提供指導(dǎo)。

整合子是具有位點(diǎn)特異性重組功能的可移動(dòng)基因元件，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合子可導(dǎo)致耐藥基因在腸桿菌科細(xì)菌間的克隆傳播。這種播散可使菌株產(chǎn)生對(duì)多種抗菌藥物的耐藥性，進(jìn)而導(dǎo)致多重耐藥菌株的暴發(fā)流行，因此又稱為耐藥整合子[14-15]。Frank等[16]研究表明，sul與dfrA可分別拮抗磺胺甲惡唑、甲氧芐啶的抗菌機(jī)制，且主要由Ⅰ型整合子介導(dǎo)，在不同菌株間進(jìn)行播散，成為病原菌對(duì)復(fù)方新諾明的重要耐藥機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方新諾明耐藥組的Ⅰ型整合子檢出率明顯高于復(fù)方新諾明敏感組，且兩組中多重耐藥菌株和廣泛耐藥菌在的Ⅰ型整合子陽(yáng)性率顯著高于非多重耐藥菌株。此外，整合子陽(yáng)性菌株對(duì)頭孢類、氨基糖苷類、喹諾酮類等臨床常用抗菌藥物耐藥率均明顯高于整合子陰性菌株。以上結(jié)果均說明整合子不僅與復(fù)方新諾明耐藥性相關(guān)，整合子上耐藥基因盒的整合與播散也是菌株獲得對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥性的重要耐藥機(jī)制，這與Xu等[7]研究結(jié)果相契合。

本研究中，肺炎克雷伯菌僅對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率呈現(xiàn)逐年降低趨勢(shì)，且耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌對(duì)復(fù)方新諾明敏感性良好。據(jù)分析，整合子與復(fù)方新諾明耐藥性、多重耐藥表型、廣泛耐藥表型的出現(xiàn)均密切相關(guān)?；趶?fù)方新諾明可作為耐碳青霉烯菌株抗感染治療的另一藥物選擇，加強(qiáng)感染控制、合理用藥、及時(shí)監(jiān)測(cè)、有效隔離等措施對(duì)保持抗菌藥物良好的敏感性、限制整合子耐藥基因的水平傳播都至關(guān)重要。

[1]Hennequin C,Robin F.Correlation between antimicrobial resistance and virulence in Klebsiella pneumonia[J].Eur J Clin Microbiol,2016,35(3):333-341.

[2]許毛宇,吳勝軍.2010-2014年杭州邵逸夫醫(yī)院臨床分離肺炎克雷伯菌的藥敏分析[J].中華全科醫(yī)學(xué),2017,15(2):304-307.

[3]Goldberg E,Bishara J.Contemporary unconventional clinical use ofco-trimoxazole[J].Clin MicrobiolInfec,2012,18(1):8-17.

[4]徐安,卓超,蘇丹虹,等.2005-2014年CHINET克雷伯菌屬細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志,2016,16(3):267-274.

[5]Grape M,Farra A,KronvallG,et al.Integrons and gene cassettes in clinical isolates of co-trimoxazole-resistant Gram-negative bacteria[J].Clin MicrobiolInfec,2005,11(3):185-192.

[6]Wayne.Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;twenty-fifth informationalsupplement[J].Document M00-S25.CLSI,2015.

[7]Xu X,LiX,Luo M,et al.Molecular characterisations of integrons in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae in a Chinese tertiary hospital[J].Microbialpathogenesis,2017,104:164-170.

[8]Mezzatesta ML,Caio C,Gona F,et al.Colistin Increases the Cidal Activity of Antibiotic Combinations Against Multidrug-Resistant Klebsiella pneumoniae:An In Vitro Model Comparing Multiple Combination BactericidalTesting at One Peak Serum Concentration and Time-Kill Method[J].Microb Drug Resist,2016,22(5):360-363.

[9]Akturk H,Sutcu M,Somer A,et al.Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae colonization in pediatric and neonatal intensive care units:risk factors for progression to infection[J].Braz J Infect Dis,2016,20(2):134-140.

[10]Huovinen P,Sundstrom L,Swedberg G,et al.Trimethoprim and sulfonamide resistance[J].Antimicrob Agents Ch,1995,39(2):279-289.

[11]樓曉清,趙锎,徐月萍,等.細(xì)菌耐藥率及抗菌藥物用藥頻度相關(guān)性分析[J].中國(guó)解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2016,32(4):357-359.

[12]楊鳳娉,王平,王業(yè)菊,等.某院細(xì)菌耐藥率與抗菌藥物用藥頻度相關(guān)性分析[J].宜春學(xué)院學(xué)報(bào),2014,36(6):59-62.

[13]Xiao SZ,Wang S,Wu WM,et al.The Resistance Phenotype and Molecular Epidemiology of Klebsiella pneumoniae in Bloodstream Infections in Shanghai,China,2012-2015[J].Frontiers in microbiol,2017,8:250.

[14]Salles MJ,Zurita J,Mejia C,et al.Resistant gram-negative infections in the outpatient setting in Latin America[J].Epidemiol Infect,2013,141(12):2459-2472.

[15]Canton R,Gonzalez-Alba JM,Galan JC.CTX-M Enzymes:Origin and Diffusion[J].Frontiers in microbiology,2012,3:110.

[16]Frank T,Gautier V,Talarmin A,et al.Characterization of sulphonamide resistance genes and class 1 integron gene cassettes in Enterobacteriaceae,Central African Republic(CAR)[J].The Journal of antimicrobial chemotherapy,2007,59(4):742-745.