羅伏鋼 李靜 陳梅芳 遲淑梅 宋明芬

老齡化是當(dāng)今社會(huì)人口發(fā)展趨勢(shì)，其中癡呆是影響人們晚年生活質(zhì)量的常見疾病之一[1-2]。目前對(duì)癡呆尚缺乏有效的治療措施，早期預(yù)測(cè)其發(fā)生的可能性以及出現(xiàn)的早晚，有利于盡早進(jìn)行干預(yù)與預(yù)防[3]。目前普遍認(rèn)為，癡呆患者在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)之前，其腦電圖（electroencephalogram，EEG）已表現(xiàn)出異常，其中特征性改變?yōu)槁ǔ霈F(xiàn)，具體表現(xiàn)為快波α波和β波活動(dòng)減少，慢波θ波和δ波頻繁出現(xiàn)，即腦電圖慢波化[3]。但是，個(gè)體發(fā)生癡呆的可能性以及何時(shí)發(fā)生是個(gè)未知數(shù)，頻繁地測(cè)定腦電圖來判斷癡呆是否發(fā)生，不僅給人們帶來不便以及造成經(jīng)濟(jì)壓力，也加重了現(xiàn)有醫(yī)療資源的不足。目前研究表明，ApoE基因多態(tài)性影響體內(nèi)載脂蛋白的功能。根據(jù)ApoE基因型對(duì)ApoE 112和158位點(diǎn)氨基酸的影響，將ApoE 基因型分為 3 種，即 ε2、ε3 和 ε4。ApoE ε2 由 ε2/ε2 和 ε2/ε3 組成，ApoE ε3 由 ε3/ε3 組成，ApoE ε4 由ε2/ε4、ε3/ε4 和 ε4/ε4 組成[2]。其中 ε4 等位基因可以顯著地升高人體內(nèi)TC濃度，使之易患動(dòng)脈粥樣硬化[4]。已有研究表明，ApoE ε4/ε4基因型在阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）、血管性癡呆（vascular dementia，VD）中的比例明顯高于對(duì)照組[5-7]。但是ApoE基因多態(tài)性與腦電圖慢波之間的關(guān)聯(lián)性尚缺乏研究。因此，本研究旨在探索ApoE基因多態(tài)性是否與癡呆發(fā)生前的腦電圖慢波及其出現(xiàn)的年齡相關(guān)，從而為預(yù)測(cè)癡呆的發(fā)生，并盡早開始干預(yù)與預(yù)防提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2016年1月至12月我院老年癡呆早期干預(yù)門診的患者112例（研究組）和周邊社區(qū)的健康人群112例（對(duì)照組）。兩組間性別、年齡、婚姻、BMI、受教育年限、降壓藥使用人數(shù)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），研究組血清TG和TC濃度均高于對(duì)照組（均P＜0.05），詳見表1。研究對(duì)象入組時(shí)，血壓均控制在正常值或正常高值范圍之內(nèi)，因部分研究對(duì)象通過降壓藥進(jìn)行血壓控制，所以入組時(shí)的血壓值，不能代表其真正的水平，故本研究沒有對(duì)血壓值進(jìn)行比較。本研究通過本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究對(duì)象本人或家屬同意參加此研究，并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：意識(shí)清，年齡、性別不限，無腦梗死及相關(guān)用藥史，詳細(xì)收集病史、體格檢查、神經(jīng)系統(tǒng)檢查、精神檢查、顱腦CT檢查均無異常者，進(jìn)行簡(jiǎn)易智能量表（MMSE）評(píng)定。MMSE評(píng)分＞24分，尚未發(fā)生癡呆者，對(duì)其進(jìn)行腦電圖檢查，將腦電圖出現(xiàn)慢波且1周后復(fù)測(cè)仍存在明確的慢波者納入研究組。同時(shí)，在周邊社區(qū)收集性別、年齡、生活習(xí)慣等匹配的正常健康對(duì)照。排除標(biāo)準(zhǔn)：吸煙，飲酒，酒精或藥物依賴，重要臟器嚴(yán)重疾病，心血管疾病，傳染病，以及可能引起繼發(fā)性腦電圖改變的疾病如顱內(nèi)占位性病變、腦外傷等。

表1 兩組研究對(duì)象一般資料

1.3 資料收集 收集性別、年齡、慢波始發(fā)年齡（若此次研究前慢波已經(jīng)確診，則根據(jù)病歷以首次明確慢波出現(xiàn)的時(shí)間）、婚姻狀況、職業(yè)、學(xué)歷、生活習(xí)慣（吸煙、飲酒、體育鍛煉情況等）、疾病史（各類急慢性軀體、精神疾病）、是否服用降壓藥物、血清TG、TC濃度等資料。

1.4 腦電圖檢查 兩組對(duì)象在體格檢查、神經(jīng)系統(tǒng)檢查、精神檢查、顱腦CT檢查均無異常后，且MMSE評(píng)分＞24分的情況下，進(jìn)行腦電圖檢查。采用美國(guó)EMS型腦電圖儀，按照國(guó)際10-20系統(tǒng)，安置頭皮電極，做16 導(dǎo) 導(dǎo) 聯(lián) 采 樣（FP1、FP2、F3、F4、C3、C4、P3、P4、O1、O2、F7、F8、T3、T4、T5、T6），接地電極置于 Fpz，雙側(cè)耳電極作為參考電極?；颊呷∽换蚺P位，清醒閉目狀態(tài)下，記錄10min。每例對(duì)象以8s為1個(gè)采樣單元，選無偽跡腦波采樣，間斷選取1個(gè)采樣單元，與健康對(duì)照比較，如α、β波減少，且θ波和δ波增多、頻率變低、波幅下降則判定為腦電圖慢波。次周重復(fù)測(cè)定，結(jié)果一致者判斷為腦電圖慢波。

1.5 ApoE基因多態(tài)性測(cè)定

1.5.1 DNA提取 腦電圖檢查結(jié)束后，采集上述研究對(duì)象的K2EDTA抗凝血液約1ml，其中0.5ml用于ApoE基因型測(cè)定，另外0.5ml用于備查。采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的血液基因組提取試劑盒抽提血液DNA。操作步驟如下：取0.5ml K2EDTA抗凝血，加入含蔗糖、Tris-HCl、氯化鎂的裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，11500×g離心1min，棄上清液，往白色沉淀中加入20mg/ml蛋白酶 K 20μl以及 10%SDS 200μl，56℃10min 進(jìn)行蛋白質(zhì)降解，加200μl無水乙醇沉淀DNA，12000r/min離心后用70%乙醇進(jìn)行清洗，最后將DNA溶解在TE緩沖液（Tris 10mmol/L、EDTA 2mmol/L）中，-20℃保存待用。離心機(jī)為美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)，型號(hào)：fresco17。

1.5.2 ApoE基因多態(tài)性測(cè)定 PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司生產(chǎn)，型號(hào)：Veriti。引物為生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)。PCR反應(yīng)分為A、B兩個(gè)反應(yīng)體系，體積均為25μl，包含以下共同組分：50ng基因組DNA，12.5μl 2×GC buffer I（Takara公司），0.8μmol/L 共同引物，序列為 5′-GTTCAGTGATTGTCGCTGGGCA-3′。A 反應(yīng)體系為擴(kuò)增半胱氨酸基因的擴(kuò)增體系，除上述成分外，還包括0.8μmol/L識(shí)別158位點(diǎn)半胱氨酸的引物（5′-ATGCCGATGACCTGCAGAATT-3′）和 0.4μmol/L 識(shí)別112位點(diǎn)半胱氨酸的引物（5′-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3′）。B反應(yīng)體系為擴(kuò)增精氨酸基因的擴(kuò)增體系，除上述共同成分外，還包含0.8μmol/L識(shí)別158位點(diǎn)精氨酸的引物（5′-ATGCCGATGATGACCTGCAGAATC-3′）和0.4μmol/L識(shí)別112位點(diǎn)精氨酸的引物（5′-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3′）。PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 4min，96℃變性 45s，66℃退火 45s，72℃延伸45s，循環(huán)35次，最后72℃延伸5min。結(jié)果判讀：A反應(yīng)液中如果112位點(diǎn)為半胱氨酸，可得到588bp的條帶；158位點(diǎn)如果為半胱氨酸，可得到451bp的條帶；B反應(yīng)液中如果112位點(diǎn)為精氨酸，可得到588bp的條帶；如果158位點(diǎn)為精氨酸，可得到451bp的條帶。根據(jù)ε2的158和112位點(diǎn)均為半胱氨酸，ε4均為精氨酸，ε3分別為半胱氨酸和精氨酸的規(guī)律，可判斷出每例被試對(duì)象的ApoE基因型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以及基因型、等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)。研究組中不同基因型間的年齡差異比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組ApoE基因型和等位基因分布比較 基因型的組間比較：研究組ε4型顯著高于對(duì)照組（χ2=31.86，P=0.000）；研究組 ε2、ε3 型明顯低于與對(duì)照組（χ2=5.25、13.03，P=0.02、0.000）。等位基因的組間比較：研究組 ε4頻率明顯高于對(duì)照組（χ2＝40.42，P=0.000）；研究組 ε2、ε3 頻率明顯低于對(duì)照組（χ2＝9.52、10.96，P=0.002、0.001）。詳見表2。

表2 兩組ApoE基因型和等位基因分布比較[例（%）]

2.2 研究組ApoE基因型與腦電圖慢化年齡的關(guān)系研究組ApoE各基因型出現(xiàn)腦電圖慢波化時(shí)的年齡：ε2型為（70.69±8.29）歲，ε3 型為（67.73±6.10）歲，ε4 型為（64.07±5.57）歲。與常見基因型 ApoE ε3 比較，ε4 基因型的腦電圖慢波始發(fā)年齡明顯減?。≒=0.003），而ApoE ε2基因型的腦電圖慢波始發(fā)年齡明顯晚于其他兩型（P=0.002和0.000）。

3 討論

ApoE是血漿重要載脂蛋白之一，其在血清TC、TG及磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝中發(fā)揮作用，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽固醇、磷脂及脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)劑和突觸發(fā)生的促進(jìn)劑[8]。ApoE有3種常見的等位基因，即ε2、ε3和ε4，這3種等位基因分別編碼3種ApoE蛋白異構(gòu)體，其區(qū)別為112位和158位氨基酸序列的不同，ε2兩位點(diǎn)均為半胱氨酸，ε4兩位點(diǎn)都為精氨酸，ε3兩位點(diǎn)分別為半胱氨酸和精氨酸。ApoE基因產(chǎn)生3種純合子（ε2/2，ε3/3，ε4/4）和 3 種雜合子（ε2/3，ε2/4，ε3/4）共 6 種常見基因型[2]。個(gè)體間ApoE功能存在著一些差異，基因多態(tài)性是造成其功能差異的主要因素[9]，其中ε4可能造成膽固醇穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、Aβ沉積等異常[10]。本研究結(jié)果顯示，研究組血清TG濃度和血清TC濃度顯著高于對(duì)照組，可能與研究組ε4的頻率明顯升高有關(guān)。

那么，血清脂質(zhì)、TC異常是否與癡呆相關(guān)呢？有研究者認(rèn)為，代謝綜合征可能與認(rèn)知能力下降顯著相關(guān)，被認(rèn)為是癡呆的危險(xiǎn)因子，而脂質(zhì)、TC異常是代謝綜合征的常見表現(xiàn)[11]。也有作者直接研究ApoE ε4基因型與癡呆的關(guān)系，如馬永興等[12]的研究表明，ApoE ε4基因型可能與認(rèn)知障礙、記憶障礙以及癡呆相關(guān)。另外，ApoE ε4基因型與老年人的壽命和認(rèn)知功能相關(guān)，攜帶ApoE ε4等位基因的健康人，更容易患輕度認(rèn)知障礙（mild cognitive impairment,MCI）[13]，眾所周知，MCI是癡呆形成前的重要前期表現(xiàn)[14]。由此可見，ApoE ε4基因型可能通過降低ApoE膽固醇載體的功能，使體內(nèi)脂質(zhì)、膽固醇代謝異常，從而促進(jìn)癡呆的發(fā)生。

腦電圖異常是癡呆的典型表現(xiàn)之一[15]。癡呆患者早在腦功能表現(xiàn)出異常之前，腦電圖已經(jīng)出現(xiàn)慢波[16]。雖然腦電圖檢查是一種無創(chuàng)傷性、價(jià)格低廉而且在一定程度上能反映大腦的電生理變化和功能異常，但是目前尚無一種方法，能判斷腦電圖異常何時(shí)發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，腦電圖慢波患者ApoE ε4基因型和等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，且該基因型出現(xiàn)慢波的平均年齡明顯早于ε2和ε3型。因此筆者認(rèn)為，ApoE ε4基因型可能與腦電圖慢化相關(guān)，攜帶此基因者，應(yīng)在更早期密切關(guān)注腦電圖的變化，有利于早期預(yù)測(cè)癡呆的發(fā)生，并適時(shí)進(jìn)行早期干預(yù)，對(duì)改善預(yù)后、提高患者生活質(zhì)量有重要的意義。

本研究仍存在不足，首先，研究對(duì)象數(shù)偏少，有些基因型的例數(shù)只有數(shù)例，如研究組ε2/ε2基因型只有2例。在以后的研究中，需延長(zhǎng)研究時(shí)間以收集更多的樣本，進(jìn)一步確認(rèn)本研究的發(fā)現(xiàn)。其次，研究組有些患者入組之前，其腦電圖已經(jīng)出現(xiàn)慢波，針對(duì)這種情況，本研究根據(jù)病歷記載，以首次確診慢波的時(shí)間作為慢波始發(fā)年齡，但是因就診習(xí)慣或檢查間隔的不同，個(gè)體間慢波始發(fā)年齡尚存在一定的差異性，下一步可設(shè)計(jì)隊(duì)列研究進(jìn)一步加以證實(shí)ApoE ε4對(duì)腦電圖慢波始發(fā)年齡的影響。總之，ApoE ε4等位基因及基因型在腦電圖慢波患者中頻率明顯升高，并具有使腦電圖慢波發(fā)生年輕化的趨勢(shì)，提示該基因與腦電圖慢波相關(guān)。

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