楊建強 羅浩杰 連煒煒 沈云佳

遺傳性對稱性色素異常癥(Dyschromatosis Symmetrica Hereditiaria，DSH，OMIM：127400)，是一種少見的高外顯率常染色體顯性遺傳病[1]。DSH臨床表現(xiàn)為手足背對稱性色素減退及色素沉著斑，部分患者顏面部位可見雀斑樣改變[2]。2003年，Zhang等[3]將本病致病基因定位在1q11-1q21區(qū)域，隨后日本學者Miyamura等[4]將致病基因確定為編碼雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶基因(adenosine deaminase，RNA specific，ADAR基因，又稱為DSRAD基因)。本研究通過對一個臨床診斷DSH家系的ADAR基因進行突變檢測，明確了DSH診斷，并為該家系的遺傳咨詢提供依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究家系來源于浙江。先證者，女，28歲。因自幼面部和手足部色素沉著斑，就診于我院皮膚科?；颊?～6歲開始面額部出現(xiàn)散在斑點狀色素沉著斑，呈褐色，繼而在雙手足背出現(xiàn)散在米粒大色素沉著和減退斑。皮損夏季較明顯，冬季顏色稍淡，但始終不消退。否認近親結婚史及其他系統(tǒng)性疾病史。系統(tǒng)檢查均未見異常。皮膚?？茩z查：面部可見較散在雀斑樣色素沉著，雙手背、足背遠端及多趾背可見散在分布的色素減退斑，伴有褐色色素沉著斑。其臨床表現(xiàn)符合DSH，但皮損范圍局限且不甚明顯(圖1)。本研究家系共4代(圖2)，其中患者3例。家系中所有患者口唇、口腔黏膜、指(趾)甲、牙齒均正常，生長發(fā)育良好。收集患者及健康家屬成員血樣共9份。結合家系遺傳史、典型的臨床表現(xiàn)初診為遺傳性對稱性色素異常癥。該女性先證者不愿作組織病理檢查。

1.2 方法

1.2.1 標本收集和DNA提取 向患者及其親屬說明研究目的和意義后，所有提供血樣的家系成員和100名無血緣關系健康對照人群。將采集外周全血3 mL，置2% EDTA抗凝劑的試管中，-80℃保存。從低溫冰箱取出外周血樣，完全融化后用Takara DNA提取試劑盒提取外周血基因組DNA。

圖1 先證者雙手背及手指背側可見散在褐色色素沉著斑和色素減退斑

家系共4代，其中3例患者，6名正常個體?！瞿行曰颊撸衽曰颊?，↑先證者

圖2 家系圖

1.2.2 引物設計與合成 根據(jù)GENEBANK中公布的人類ADAR基因的cDNA序列。為擴增該基因全長采用Primer5.0軟件設計12對PCR特異性擴增引物。其所擴增的序列涵蓋了ADAR基因的全部15個外顯子的編碼區(qū)域及內含子連接區(qū)域序列。引物由上海華大基因科技有限公司合成。其中2號外顯子的引物序列(表1)。

表1 用于擴增2號外顯子的引物序列

1.2.3 基因擴增、測序和序列比對 把提取的基因組DNA標化定量，并進行PCR擴增。PCR反應在Biometra PCR儀上進行，PCR反應體系(25 μL)，其中包括：10 x buffer(含Mgcl2)2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.5 U，l0 mmol/L雙向混合引物0.5 μL，標化DNA模板1 μL，加滅菌雙蒸水至25 μL。反應條件為：預變性95℃ 5 min，35個循環(huán)包括：變性94℃ 40 s、退火58℃ 60 s、延伸72℃ 55 s，最后延伸72℃ 10 min。根據(jù)PCR產(chǎn)物片段長度，采用1.5%～2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR擴增的產(chǎn)物片段經(jīng)割膠回收特異性目的條帶，方法參照QIAgen純化回收試劑盒說明書，回收膠塊中的PCR產(chǎn)物片斷[5]，送上海華大基因有限公司進行雙向反應測序，將測序結果所得序列與Genbank中人類ADAR基因的標準序列比對。

2 結果

通過12對引物進行PCR擴增，獲取患者和正常人的ADAR基因組中特異性片段。對患者各個PCR產(chǎn)物進行純化、直接雙向測序，發(fā)現(xiàn)第2號外顯子第982位堿基呈雙峰改變(c.982C>T，p.R328X)，但在家系中健康個體和無血緣關系的正常人中無相應突變。該突變(c.982C>T，p.R328X)，可致使mRNA提早出現(xiàn)終止密碼，最終導致氨基酸的翻譯出現(xiàn)提前終止和蛋白質的截短。先證者兒子年幼(3歲)，其母曾擔心其是否具有該遺傳性疾病，但經(jīng)檢測未發(fā)現(xiàn)該突變(圖3)。

3a：患者序列中可見c.982C>T突變；3b：健康個體中并未發(fā)現(xiàn)該突變

圖3 家系中患者和正常個體ADAR基因2號外顯子測序片段比對

3 討論

DSH亦稱Dohi(網(wǎng)狀)肢端色素沉著，是較少見的一種外顯率較高的常染色體顯性遺傳性皮膚病。DSH在日本人群和中國人群中相對報道較多[6]。該病主要累及暴露部位皮膚，尤其是手足背部位，部分患者可伴發(fā)面部、頸部和前上胸部雀斑，因而影響美觀，常給患者帶來較大的心理負擔。該病組織病理可見：色素沉著斑處表皮棘層下部和基底層內黑素增加，真皮上部嗜黑素細胞增多及少量淋巴細胞浸潤，而色素減退斑處基底層色素減少乃至消失[6]。

自從2003年發(fā)現(xiàn)該病的致病基因以來，針對該病的基因診斷的報道逐漸增加。該病的致病基因--ADAR基因，又稱為DSRAD基因(double-stranded RNA-specific adenosine deaminase)，全長約40 kb，包括15個外顯子，編碼了含有1226個氨基酸序列的蛋白質，其中2號外顯子、2～7號外顯子和9～14號外顯子分別編碼了ADAR蛋白分子中的2個Z-DNA結合區(qū)域(Z-α和Z-β)、3個雙鏈RNA結合區(qū)域(dsRNA 結合區(qū)域，DSRM)和1個脫氨酶(ADEAMc)區(qū)域，構成了一個完整的雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶[7,8]。

本研究家系具有典型的臨床表現(xiàn)和常染色體顯性遺傳特征，臨床診斷為DSH。DSH的發(fā)病常在幼年起病，逐漸出現(xiàn)面部雀斑樣改變和手足背部色素沉著斑和減退斑，本研究中先證者兒子尚年幼，暫無明顯色素異常。但先證者希望能進一步開展基因診斷并了解其兒子是否遺傳該病。

本實驗研究采用對ADAR基因進行了外顯子的PCR擴增并直接測序，發(fā)現(xiàn)該家系中所有患者存在第982位堿基發(fā)生無義突變(c.982C>T)，這導致mRNA在第328位氨基酸提早出現(xiàn)終止密碼(p.R328X)，進而可能導致該蛋白分子Z-alpha區(qū)域的缺陷。該家系正常成員和100名無血緣關系的正常對照均不存在此改變。本研究發(fā)現(xiàn)的c.982C>T突變，也曾為Hou等[9]所報道，說明該突變有可能是存在于浙皖地區(qū)漢族人DSH患者中ADAR基因的突變熱點，有待于今后對DSH患者人群的進一步研究。

截止2017年2月，人類遺傳基因數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Mutation Database，HGMD，http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=ADAR)報道了155個位點突變或突變類型，其中包括了10個導致Aicardi-Goutières syndrome的突變。Aicardi-Goutières syndrome(Aicardi-Goutières 綜合征，AGS)是一種罕見的幼年自體免疫疾病，可表現(xiàn)為后天性小頭畸形、基底節(jié)區(qū)鈣化、腦白質營養(yǎng)不良、腦萎縮、腦脊液慢性淋巴細胞及α-干擾素增多為特征的遺傳性腦病，與ADAR等數(shù)個基因變異有關[10]。但是本研究中家系均未出現(xiàn)任何免疫和神經(jīng)發(fā)育不良的特征，不支持該病診斷。

本研究通過ADAR基因突變篩查，明確了該病的診斷，且通過對家族中幼兒的基因檢測，排除了c.982C>T突變，提示該成員為健康個體。為向該家系開展遺傳咨詢提供依據(jù)。

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