李璐璐 尤家寶 付希安 于功奇 劉 紅 張福仁

泛發(fā)性膿皰型銀屑病(generalized pustular psoriasis, GPP)是一種病因不明、危及生命的系統(tǒng)性炎癥性皮膚病。該病常表現(xiàn)為突然、反復(fù)發(fā)作的高熱、泛發(fā)性皮疹及播散性無菌性膿皰，常伴有白細(xì)胞和 C反應(yīng)蛋白升高，嚴(yán)重者可累及內(nèi)臟器官，甚至危及生命[1]。該病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究已經(jīng)證實遺傳因素在疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。 2011 年， Marrakchi等[3]最先采用純合子定位與直接測序法發(fā)現(xiàn)9個GPP家族均攜帶同一IL36RN 純合子錯義突變，此突變導(dǎo)致 IL36Rα 結(jié)構(gòu)和功能變異從而發(fā)生 GPP，使得 GPP 的遺傳研究取得了突破性的進(jìn)展。2012年，Jordan等[4]首次報道1例歐洲散發(fā)GPP患兒的CARD14基因c.413A>C(p.Glu138Ala)突變。我們團(tuán)隊在2014年也對62例GPP進(jìn)行了IL36RN基因檢測，發(fā)現(xiàn)了2個新的突變位點，這些病例的CADR14基因測序，發(fā)現(xiàn)了4個新的突變位點。2個基因在GPP患者群體的突變率分別為46.77%(基因IL36RN)，4.8%(基因CARD14)，顯示GPP的發(fā)病具有遺傳異質(zhì)性[5,6]。最近， Setta-Kaffetzi等[7]首次報道了歐洲膿皰型銀屑病人群中AP1S3基因2個有害的少見突變位點，分別為c.11T>G(p.Phe4Cys)、c.97C>T(p.Arg33Trp)，該發(fā)現(xiàn)尚未在其他種群中得到驗證。因此為系統(tǒng)闡釋GPP的遺傳發(fā)病機(jī)制，探討AP1S3基因是否與中國漢族種群GPP相關(guān)，我們收集了2014-2017年在我院住院的107例GPP，對其進(jìn)行了AP1S3基因測序，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象根據(jù)GPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，將2014年1月至2017年2月山東省皮膚病醫(yī)院住院患者中確診為GPP的107例納入研究，所有患者病史資料完整?；颊呓詾橹袊鴿h族。其中男60例，女47例，男∶女=1.3∶1。年齡5～76 (35.44±18.02)歲，發(fā)病年齡(31.47±18.55)歲，男性患者年齡(33.93±18.73)歲，女性患者年齡(37.06±17.19)歲，二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.332)。我們的研究根據(jù)是否合并尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris，PV)癥狀,將所有GPP患者分為不合并PV癥狀的GPP(GPP alone)和合并PV癥狀的GPP(GPP with PV)；根據(jù)GPP的發(fā)病年齡分為兒童型泛發(fā)性膿皰型銀屑病(pediatric-onset GPP, PGPP)和成人型泛發(fā)性膿皰型銀屑病(adult-onset GPP, AGPP)。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA制備 本研究獲得山東省皮膚病醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，在獲得知情同意的前提下，抽取107例GPP患者外周靜脈血5 mL,乙二胺四乙酸二鉀(EDTAK2)抗凝，用TGuide大體積血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取外周全血DNA，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。提取后的DNA用全波長紫外/可見光掃描分光光度計ND-8000(NanoDrop公司)測定其純度及含量，要求A260/A280>1.8，根據(jù)DNA原液濃度將DNA原液標(biāo)化為30 ng/μL的DNA模板至96孔板內(nèi)。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 擬擴(kuò)增AP1S3基因(參考號NR_110905.1)的1、2、3、4、5五個外顯子的引物設(shè)計序列見表1[7]，由北京華大基因研究中心合成。PCR反應(yīng)在便攜式PCR擴(kuò)增試劑盒(2×Taq PCR MasterMix)中進(jìn)行。反應(yīng)體系12.5 μL:Taq Mix(為dNTP、Taq酶和緩沖液的混合物)6.5 μL,滅活的去離子水ddH2O 5 μL,引物(F+R)0.5 μL，模板DNA 0.7μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min,進(jìn)行以下35個循環(huán):95℃變性40 s,退火(退火溫度見表1)，72℃延伸1 min,最后72℃延伸10 min。12 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。GelRed染色攝片。

1.2.3 DNA測序 將所有陽性擴(kuò)增條帶的樣本采用乙醇醋酸鈉純化法純化。分離純化后的DNA采用雙脫氧鏈終止法(Sanger 測序法)，在ABI 3500XL DNA測序分析儀(美國Applied Biosystem 公司)上進(jìn)行基因測序。測序結(jié)果與NCBI下載的參考序列同時輸入NCBI Nucleotide BLAST中進(jìn)行比對分析。測序引物采用各外顯子的上游引物。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用非參數(shù)檢驗、t檢驗、χ2檢驗等方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 PCR擴(kuò)增AP1S3基因外顯子引物序列和退火溫度及產(chǎn)物片段

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 107例GPP患者中包括無PV癥狀的GPP 31例，男13例，女18例，年齡(31.19±21)歲，發(fā)病年齡(23.32±20.43)歲；合并PV癥狀的GPP 76例，男46例，女30例，年齡(36.99±16.57)歲，發(fā)病年齡(34.79±16.87)歲。無PV癥狀的GPP及合并PV癥狀的GPP性別構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.028，P=0.876)，GPP alone及GPP with PV發(fā)病年齡差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.773,P=0.004)。PGPP 31例，男20例，女11例，年齡(15.06±8.77)歲；AGPP 76例，男28例，女36例，年齡(43.57±13.84)歲。PGPP及AGPP性別構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.603，P=0.058)，見表2。

表2 107例GPP患者的基本臨床資料

2.2 AP1S3測序結(jié)果 107例GPP患者AP1S3基因所有外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段與所設(shè)計的片段大小一致，無非特異性擴(kuò)增帶。其產(chǎn)物經(jīng)測序比對后發(fā)現(xiàn)，107例GPP患者AP1S3基因5個外顯子中均未發(fā)現(xiàn)任何少見突變、低頻突變及SNP位點。

3 討論

GPP是一種少見的危及生命的系統(tǒng)性炎癥性疾病，臨床以突然發(fā)生并反復(fù)出現(xiàn)的紅斑基礎(chǔ)上粟粒大的無菌性膿皰為特點，可泛發(fā)全身，并伴有高熱及全身不適。1910年，Zumbusch首次對該病進(jìn)行了描述。統(tǒng)計顯示GPP在歐洲及日本國家的發(fā)病率為0.6/100萬～0.7/100萬，但中國僅有病例報道，尚無相關(guān)數(shù)據(jù)[9]。在臨床上，根據(jù)有無尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris, PV)癥狀，GPP分為單純性GPP(GPP without PV, GPP alone)及伴隨PV癥狀的GPP(GPP with preceding, later or accompanied by PV, GPP with PV)。根據(jù)GPP的發(fā)病年齡，18周歲之前發(fā)病的患者歸為兒童型GPP(pediatric-onset GPP, PGPP)，18周歲之后發(fā)病的患者歸為成人型GPP(adult-onset GPP, AGPP)[2]。我們的研究包括107例中國GPP患者，其中包括31例無PV癥狀的GPP(GPP alone)及76例伴隨PV癥狀的GPP患者(GPP with PV)，包括31例PGPP及76例AGPP，不同組別之間性別構(gòu)成比無差異；少數(shù)的無PV癥狀的GPP(GPP alone)患者的發(fā)病年齡明顯低于大多數(shù)的伴隨PV癥狀的GPP(GPP with PV)患者，與之前的研究結(jié)果[10]相符,提示無PV癥狀的GPP可能是GPP的獨特亞型，不同于伴隨PV癥狀的GPP。

GPP的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究已經(jīng)證實患者的遺傳因素在疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[2]，IL36RN、CARD14基因先后在歐洲種群與中國種群中被證實與GPP發(fā)病相關(guān)，只有少部分GPP患者攜帶IL36RN或CARD14基因突變，提示該病具有遺傳異質(zhì)性。最近在2014年，Setta-Kaffetzi等[7]通過對7例Hallopeau連續(xù)性肢端皮炎進(jìn)行外顯子測序，發(fā)現(xiàn)AP1S3基因突變，同時他們對256例膿皰型銀屑病(包括72例亞洲GPP患者)進(jìn)行了直接測序驗證，發(fā)現(xiàn)AP1S3基因2個有害的少見突變，分別為c.11T>G(p.Phe4Cys)、c.97C>T(p.Arg33Trp)，基因突變頻率達(dá)到5.9%，與3388例正常對照的突變率1.4%相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=2.5×10-7)，但在72例亞洲患者中亦未發(fā)現(xiàn)任何突變。隨后，Capon團(tuán)隊[11-13]對99例亞洲GPP患者(絕大多數(shù)為馬來西亞人，具體不詳)AP1S3基因進(jìn)行了直接測序，未發(fā)現(xiàn)突變。2017年M?ssner等[14]研究發(fā)現(xiàn)32 864例非法國籍歐洲正常對照AP1S3基因的少見突變等位基因頻率2.3%與51例歐洲GPP患者AP1S3基因的少見突變等位基因頻率2.0%相比無差異。因此對于GPP與AP1S3基因相關(guān)性的認(rèn)識存在諸多爭議。AP1S3基因編碼AP-1蛋白的σ1亞單位的一種異構(gòu)體σ1C，Sugiura等[11]通過構(gòu)建三維蛋白模型發(fā)現(xiàn)報道的兩處突變可嚴(yán)重破壞AP1的穩(wěn)定性，作者發(fā)現(xiàn)敲除AP1S3基因的HaCaT細(xì)胞，轉(zhuǎn)運至內(nèi)吞體的先天性模式識別受體Toll樣受體3 (TLR-3)明顯減少，導(dǎo)致TLR-3介導(dǎo)信號通路中IFN-β表達(dá)顯著下降。IFN-β不僅本身具有抗炎功能還能下調(diào)抗炎因子IL-1的表達(dá)，從而抑制皮膚炎癥的發(fā)生。因此AP1S3基因缺陷干擾TLR-3在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運，進(jìn)而抑制其下游IFN-β表達(dá)下降，IL-1及IL36Tα細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致皮膚炎癥的發(fā)生。本研究中我們對107例中國漢族GPP患者AP1S3基因進(jìn)行了Sanger直接測序，亦未發(fā)現(xiàn)任何少見突變、低頻突變及SNP位點，結(jié)合既往研究推測AP1S3基因可能與亞洲GPP患者疾病的發(fā)生并無相關(guān)性。

我們的研究提供了中國人群GPP患者AP1S3基因測序的結(jié)果，但未發(fā)現(xiàn)AP1S3基因突變與中國人群GPP的發(fā)病相關(guān)。結(jié)合 Setta-Kaffetzi等[7]、Mahil等[13]及M?ssner等[14]的研究結(jié)果，AP1S3基因突變導(dǎo)致TLR-3穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)囊泡轉(zhuǎn)運障礙從而發(fā)生膿皰性皮膚病，但其在各族人群中的發(fā)病率及其相關(guān)的疾病譜仍需大量的樣本數(shù)據(jù)支持。膿皰型銀屑病作為一種多基因遺傳疾病，其遺傳模式尚不確定，仍需要開展深入的遺傳學(xué)研究，以便為進(jìn)一步遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷和靶向治療藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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