張相鑫 陳 澄 唐志如 甄吉福 許慶慶 孫志洪*

(1.西南大學(xué)生物飼料與分子營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400715)

近年來(lái)，隨著集約化程度的提高，養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的氮污染越來(lái)越嚴(yán)重。我國(guó)每年生豬養(yǎng)殖所帶來(lái)的氮排放量在1 800 t左右。因此，提高豬對(duì)蛋白質(zhì)的利用效率，減少氮排放量，具有重要的科學(xué)和社會(huì)意義。目前，低蛋白質(zhì)飼糧是降低豬氮排放量的通用技術(shù)。研究表明，降低1%的豬飼糧粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)水平可減少8%左右的氮排放量[1]。在補(bǔ)充必需氨基酸的情況下，飼糧CP水平可以降低2%～4%而不影響豬的生長(zhǎng)發(fā)育[2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，降低飼糧CP水平，僅平衡重要的必需氨基酸(EAA)[賴(lài)氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、色氨酸(Trp)和蘇氨酸(Thr)]會(huì)顯著增加EAA在肝臟組織中的消耗量[3]。本試驗(yàn)擬研究飼糧CP水平對(duì)斷奶仔豬肝臟氨基酸代謝酶活性及轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的影響，為闡明低蛋白質(zhì)飼糧增加EAA在豬肝臟中的消耗量、減少氮排放的機(jī)制及如何提高斷奶仔豬肝臟氨基酸代謝轉(zhuǎn)化效率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)飼糧

選用28日齡、體重[(7.0±0.5) kg]相近、健康的“杜×長(zhǎng)×大”雜交斷奶仔豬54頭(公母各占1/2)，隨機(jī)分為3組[20% CP組(對(duì)照組)、17%CP組和14% CP組]，每組18個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。17%和14% CP組添加Lys、Met、Thr和Trp，使之水平與對(duì)照組一致?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2012)進(jìn)行配制，試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of diets：VA 10 500 IU，VD 4 500 IU，VE 5.4 IU，VK 0.9 mg，VB64.6 mg，VB120.016 mg，生物素 biotin 0.05 mg，葉酸 folic acid 0.29 mg，尼克酸 nicotinic acid 29.2 mg，泛酸 pantothenic acid 9.5 mg，膽堿 choline 0.45 g，核黃素 riboflavin 3.2 mg，硫胺素 thiamine 1.0 mg，Zn (as zinc sulfate) 86 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 97 mg，Mn (as manganese sulfate) 3.3 mg，Cu (as copper sulfate) 5.3 mg，I (as potassium iodide) 0.14 mg，Se (as sodium selenite) 0.265 mg。

2)消化能為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值。DE was a calculated value, while the others were measured values.

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在西南大學(xué)動(dòng)物養(yǎng)殖基地進(jìn)行。預(yù)試期7 d，正試期45 d。試驗(yàn)仔豬置于不銹鋼籠(1.50 m×0.68 m×0.75 m)中進(jìn)行飼養(yǎng)，每籠1頭。養(yǎng)殖房溫度控制在(25±1) ℃，試驗(yàn)仔豬均自由采食、飲水。每天于08:00、18:00進(jìn)行飼喂。試驗(yàn)期間保持圈內(nèi)清潔、干燥。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)期間，利用四分法采集各組飼糧3次，混合后粉碎過(guò)40目篩，常溫保存。參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[4]檢測(cè)飼糧的干物質(zhì)、CP、鈣、磷、粗纖維和氨基酸等的含量。

于正試期的第10、25和45天，從每組挑選與平均體重最為接近的6頭仔豬進(jìn)行屠宰。采集肝臟樣品，液氮冷凍后于-80 ℃保存。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 肝臟氨基酸代謝酶活性

稱(chēng)取0.6～0.9 g肝臟組織，放入預(yù)先添加0.9%冷藏生理鹽水的10 mL離心管中，肝臟重量與生理鹽水體積比為1∶9，然后置于冰上勻漿。勻漿結(jié)束后在3 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，吸取上清液于-20 ℃保存，待測(cè)各種氨基酸代謝酶的活性。

比色法測(cè)定肝臟組織中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，GPT)(C009-2)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase，GOT)(C010-2)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)(A047)及谷氨酸脫氫酶(glutamic acid dehydrogenase，GDH)(A125)的活性，上述指標(biāo)測(cè)定所用

試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，測(cè)定方法嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.2 肝臟氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)

1.4.2.1 RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄

取-80 ℃保存的肝臟組織置于冰上，用已滅菌的剪刀將肝臟組織剪細(xì)，倒入液氮充分研磨(防止肝臟組織升溫失活)，待研磨均勻后將粉末狀肝臟裝入離心管內(nèi)。用Total RNA Extractor(上海生物工程有限公司)提取肝臟組織RNA，已提取的肝臟組織RNA用MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit(上海生物工程有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.4.2.2 引物設(shè)計(jì)

采用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成。肝臟氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體可溶性載體6家族成員15(solute carrier family 6 member 15，SLC6A15)、可溶性載體6家族成員20(SLC6A20)、可溶性載體36家族成員1(SLC36A1)、可溶性載體38家族成員2(SLC38A2)及內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的引物序列見(jiàn)表2。

表2 目的基因和內(nèi)參基因的引物序列

1.4.2.3 熒光定量PCR

熒光定量PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中包括Hotstart Fluo-PCR mix 24 μL，上下游引物各2 μL(25 μmol/L)，cDNA 2 μL，ddH2O 20 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，60～63 ℃退火30 s(根據(jù)引物最適溫度而定)，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)試劑均購(gòu)自上海生物工程有限公司。采用比較Ct值法進(jìn)行相對(duì)定量表達(dá)差異的計(jì)算，目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct(循環(huán)閾值，cycle threshold)，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)試驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組，2-△△Ct表示試驗(yàn)組目的基因的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行整理，再使用SAS 8.2軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧CP水平對(duì)斷奶仔豬肝臟氨基酸代謝酶活性的影響

由圖1可知，試驗(yàn)第10天時(shí)，14%和17% CP

組斷奶仔豬的肝臟GOT活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；第25天時(shí)，14% CP組的肝臟GOT活性顯著低于其他2組(P<0.05)。第25天時(shí)，14%和17% CP組的肝臟GPT活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；第45天時(shí)，14% CP組的肝臟GPT活性顯著低于其他2組(P<0.05)。試驗(yàn)期第10和45天時(shí)，14% CP組的肝臟GS活性顯著低于其他2組(P<0.05)；第25天時(shí)，14% CP組的肝臟GS活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。第25天時(shí)，14%和17% CP組的肝臟GDH活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 飼糧CP水平對(duì)斷奶仔豬肝臟氨基酸代謝酶活性的影響

2.2 斷奶仔豬肝臟氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)

2.2.1 熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)和溶解曲線(xiàn)分析

由圖2可知，在GAPDH、SLC6A15、SLC6A20、SLC36A1及SLC38A2的擴(kuò)增過(guò)程中，基線(xiàn)平穩(wěn)，說(shuō)明產(chǎn)生干擾的信號(hào)小。此外，擴(kuò)增中設(shè)計(jì)的非模板對(duì)照(NTC)為平穩(wěn)直線(xiàn)，說(shuō)明試驗(yàn)過(guò)程中溶液沒(méi)有污染和引物二聚體出現(xiàn)。

由圖3可知，在GAPDH、SLC6A15、SLC6A20、SLC36A1及SLC38A2的溶解曲線(xiàn)中均顯示出1個(gè)單一尖銳峰，說(shuō)明擴(kuò)增過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，引物特異性較好。

2.2.2 飼糧CP水平對(duì)斷奶仔豬肝臟氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的影響

由表3可知，試驗(yàn)第25和45天時(shí)，14% CP組斷奶仔豬的肝臟SLC6A15的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于其他2組(P<0.05)；第25天時(shí)，14%和17% CP組的肝臟SLC36A1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，14% CP組的肝臟SLC38A2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；第45天時(shí)，14%和17% CP組的肝臟SLC6A20和SLC38A2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖2 熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

圖3 熒光定量PCR溶解曲線(xiàn)

3 討 論

3.1 飼糧CP水平對(duì)斷奶仔豬肝臟氨基酸代謝酶活性的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，斷奶仔豬肝臟GOT和GPT活性隨飼糧CP水平的升高而增加。GOT又稱(chēng)天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，可以催化α-酮戊二酸(α-KG)和天冬氨酸(Asp)形成谷氨酸(Glu)和草酰乙酸。GPT又名谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶，可以催化α-KG和丙氨酸(Ala)形成Glu與丙酮酸。GOT和GPT是氨基酸代謝轉(zhuǎn)化過(guò)程中的重要酶，且在肝臟內(nèi)活性較高。GOT和GPT主要存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)組織細(xì)胞受到損害時(shí)，GOT和GPT就會(huì)通過(guò)細(xì)胞流入血液，因此GOT和GPT是檢驗(yàn)肝臟功能的一個(gè)重要指標(biāo)[5]。有關(guān)飼糧CP水平對(duì)豬肝臟GOT和GPT活性影響的報(bào)道結(jié)果并不一致。羅鈞秋[6]研究表明，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足時(shí)，會(huì)導(dǎo)致豬肝臟合成蛋白質(zhì)的能力受到損傷，導(dǎo)致血漿GOT和GPT活性顯著增加。羅洪明[7]報(bào)道認(rèn)為，隨飼糧CP水平的增加，仔豬血漿GOT和GPT活性呈先增加后下降再增加的趨勢(shì)。從以上研究報(bào)道可以

看出，判定CP水平對(duì)GOT和GPT活性的影響，需要明確飼糧CP水平處于何種狀態(tài)(正常、過(guò)營(yíng)養(yǎng)、缺乏)，處于不同狀態(tài)降低或增加相同水平的CP對(duì)機(jī)體GOT和GPT活性的影響是不同的。本研究表明，降低飼糧CP水平可能會(huì)減少仔豬肝臟中Glu的合成量。

表3 飼糧CP水平對(duì)斷奶仔豬肝臟氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

本研究顯示，降低飼糧CP水平會(huì)降低斷奶仔豬肝臟GS和GDH活性。GS是參與氨代謝的一種關(guān)鍵酶，存在于所有生物體內(nèi)，催化L-Glu轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺(Gln)[8]。GS在機(jī)體內(nèi)具有重要的作用，不僅能夠參與組織間氮的運(yùn)輸，降解體內(nèi)高濃度的氨，而且還能夠維持機(jī)體的酸堿平衡。GDH廣泛存在于肝臟組織中，在氨基酸氧化脫氨基反應(yīng)過(guò)程中具有重要作用。一般情況下，GDH可催化α-亞氨基戊二酸合成Glu。此外，在氨基酸脫氨基反應(yīng)過(guò)程中，GDH能夠和轉(zhuǎn)氨酶形成Gln和天冬酰胺，并轉(zhuǎn)化為尿素[9]。羅鈞秋[6]研究報(bào)道，飼糧不同氨基酸組成對(duì)豬血漿GDH活性的影響不顯著，結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果(降低飼糧CP水平會(huì)降低肝臟GDH和GS活性)可以推測(cè)，飼糧氨基酸的數(shù)量對(duì)肝臟GDH和GS活性具有重要影響。

3.2 飼糧CP水平對(duì)斷奶仔豬肝臟氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的影響

本研究結(jié)果顯示，所檢測(cè)的4種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA相對(duì)表達(dá)量均在不同程度上隨飼糧CP水平的降低而降低。SLC6A15是可溶性載體6家族(solute carrier family 6，SLC6)的成員之一，是一種結(jié)合Na+和Cl-的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體。Uhl等[10]于1992年發(fā)現(xiàn)了SLC6A15，并依據(jù)其在SLC6的作用，將其命名為SLC6A15、BoAT2、SBAT1或V7-3。Takanaga等[11]研究證實(shí)，SLC6A15可以調(diào)節(jié)脯氨酸(Pro)、Met、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)和異亮氨酸(Ile)的代謝轉(zhuǎn)化。H?gglund等[12]研究發(fā)現(xiàn)，SLC6A15可以改變Leu的濃度，從而調(diào)節(jié)機(jī)體器官內(nèi)的能量代謝。Drgonova等[13]研究表明，敲除小鼠的SLC6A15基因?qū)е翷eu和Pro攝取量分別下降40%和15%。H?gglund等[14]研究發(fā)現(xiàn)，SLC6A15的mRNA表達(dá)主要在大腦，在肌肉、腸道、肝臟和眼睛中也能檢測(cè)到部分SLC6A15的mRNA表達(dá)。

SLC6A20又名SIT1，是一種結(jié)合Na+和Cl-的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體。SLC6A20主要分布于哺乳動(dòng)物的腸道和腎臟中，是Pro代謝過(guò)程中的重要成分，其通過(guò)結(jié)合Glu、精氨酸(Arg)和其他氨基酸而影響機(jī)體的糖穩(wěn)態(tài)和能量穩(wěn)態(tài)[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，SLC6A20在腎臟中可調(diào)節(jié)Ⅱ型糖尿病[17]。此外，亞氨基甘氨酸尿癥與SLC6A20的突變也存在一定的聯(lián)系[18]。由于SLC6A20發(fā)現(xiàn)的比較晚，目前關(guān)于其在肝臟中的調(diào)節(jié)機(jī)制報(bào)道較少。

SLC36A1又名PAT1，是一種編碼質(zhì)子結(jié)合氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其主要分布于腸道和腎臟中，在肝臟中也有少量的mRNA表達(dá)[15]。SLC36A1能夠轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)體內(nèi)Ala、Pro、甘氨酸(Gly)等各類(lèi)小氨基酸。在一定H+濃度條件下，SLC36A1選擇性激活Na+/H+交換體Ⅲ產(chǎn)生亞氨基酸，從而使機(jī)體內(nèi)H+濃度維持在正常水平[19]。Chen等[20]研究發(fā)現(xiàn)，SLC36A1在人體的小腸、大腦、肝臟、睪丸和腎臟組織中均有表達(dá)。

SLC38A2是SLC6家族成員之一，它是一種Na+依賴(lài)的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，存在于哺乳動(dòng)物組織中。SLC38A2幾乎在所有細(xì)胞類(lèi)型中都能表達(dá)[21]。Ortiz等[22]研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠飼喂高蛋白質(zhì)飼糧可以增加SLC38A2的表達(dá)，這表明SLC38A2能夠?qū)C(jī)體內(nèi)多余蛋白質(zhì)通過(guò)氨基酸的形式進(jìn)行氧化分解。Conti等[23]研究表明，SLC38A2能夠結(jié)合Gln進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并參與Glu-Gln代謝循環(huán)。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬肝臟SLC38A2的mRNA相對(duì)表達(dá)量隨飼糧CP水平的增加而增加，這與Ortiz等[22]的研究結(jié)果相一致。

仔豬肝臟氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA相對(duì)表達(dá)量隨飼糧CP水平的變化趨勢(shì)與氨基酸代謝酶活性的變化趨勢(shì)一致?？傮w來(lái)看，降低飼糧CP水平3%和6%會(huì)減少某些氨基酸(如Glu、Pro、Arg、Leu等)進(jìn)入肝細(xì)胞的數(shù)量，從而降低這些氨基酸在肝臟中的代謝速率。

4 結(jié) 論

① 飼糧CP水平降低3%和6%會(huì)顯著降低斷奶仔豬肝臟氨基酸代謝酶(GOT、GPT、GS、GDH)活性。

② 飼糧CP水平降低3%和6%會(huì)顯著降低斷奶仔豬肝臟氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(SLC6A15、SLC6A20、SLC36A1、SLC38A2)的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

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