李佳駿 王振華 胡正茂 唐慧琴 谷笑笑 廖成斌 潘康成*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物微生態(tài)工程研究中心，成都 611130；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，成都 611130；3.成都中牧生物藥業(yè)有限公司，成都 610000)

枯草芽孢桿菌為國際公認的可在飼料中直接使用的微生物菌種，能夠維持和調(diào)整腸道菌群平衡，增強機體免疫力，分泌多種消化酶，提高飼料消化利用率，促進動物的生長[1-2]。枯草芽孢桿菌不分泌毒素、安全性好、易于基因調(diào)控、無密碼子偏愛性、生長快、易于培養(yǎng)，基因重組后所表達的外源蛋白可直接分泌到環(huán)境中，為優(yōu)良的外源蛋白表達系統(tǒng)；但其同時也能分泌蛋白酶，導(dǎo)致其作為分泌表達系統(tǒng)存在著一定的局限性；而枯草芽孢桿菌的芽孢具有耐酸、鹽、擠壓、高溫，生產(chǎn)中芽孢易純化、成本低等優(yōu)點，因而，使其芽孢表面用于展示外源功能蛋白已成為研究熱點[3-4]。Lian等[5]將人類生長因子(hGH)表面展示于枯草芽孢桿菌芽孢衣殼并飼喂家蠶，結(jié)果顯示展示于芽孢衣殼表面的hGH蛋白可以被家蠶消化吸收至血淋巴。Zhou等[6]將幽門螺桿菌脲酶B蛋白展示于枯草芽孢桿菌芽孢衣殼表面并飼喂小鼠后發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生糞便脲酶B特異性分泌型免疫球蛋白A(SIgA)和血清免疫球蛋白G(IgG)。劉明剛等[7-8]構(gòu)建了表面展示雞白痢沙門氏菌外膜蛋白OmpC的重組枯草芽孢桿菌SE1制劑，并經(jīng)口給予小鼠，發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)小鼠抗雞白痢沙門氏菌特異性抗體并對鼠傷寒沙門氏菌病具有一定的交叉保護作用。但將表面展示技術(shù)用于構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌對動物生長性能、腸道消化酶活性和菌群的影響鮮有報道。本試驗以白羽肉雞為試驗對象，將表面展示雞白痢沙門氏菌外膜蛋白OmpC的重組枯草芽孢桿菌SE1飼喂肉雞，研究其對肉雞生長性能、腸道消化酶活性和菌群的影響，比較其與枯草芽孢桿菌168效果的差異，為該重組菌的應(yīng)用提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枯草芽孢桿菌168制劑(活芽孢數(shù)為1.0×109CFU/g)、表面展示雞白痢沙門菌外膜蛋白OmpC的重組枯草芽孢桿菌SE1制劑(活芽孢數(shù)為1.0×109CFU/g)均由本研究中心提供。

1.2 試驗設(shè)計與試驗飼糧

選擇7日齡科寶 500(Cobb-500)肉雞120只，隨機分為3組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞。A組(對照組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，B組在基礎(chǔ)飼糧中添加0.1%(1.0×106CFU/g)枯草芽孢桿菌168制劑，C組在基礎(chǔ)飼糧中添加0.1%(1.0×106CFU/g)重組枯草芽孢桿菌SE1制劑，添加量由前期相關(guān)預(yù)試驗確定?；A(chǔ)飼糧(無抗菌藥物)由成都市彭州某飼料廠提供，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗雞采用單層籠養(yǎng)，各組分別隔離飼養(yǎng)，紅外燈保溫，平均室溫為26 ℃左右。自由采食、飲水，定期清潔雞籠。每天觀察雞群的采食、飲水和健康情況，記錄耗料量和發(fā)病、死亡情況，試驗期35 d。于7和21日齡時用新城疫弱毒疫苗進行點眼、滴鼻免疫。

1.4 指標(biāo)測定與方法

1.4.1 生長性能

于42日齡時對試驗雞進行空腹稱重，稱重前斷料8 h，斷水2 h，計算平均增重、料重比。

1.4.2 腸道消化酶活性

于28和42日齡時，各重復(fù)取3只試驗雞剖殺，取空腸和回腸腸段，用生理鹽水沖洗掉內(nèi)容物

(至無明顯內(nèi)容物即可，生理鹽水量無特定要求)，置于冰袋上小心刮取腸黏膜，放于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)至-70 ℃保存，用于消化酶活性的測定。采用南京建成生物工程研究所的消化酶活性試劑盒，按照操作說明測定淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of diets:VA 12 500 IU，VB26 mg，VB312 mg，VB120.025 mg，VD32 500 IU，VE 18.75 IU，VK 32.65 mg，生物素 biotin 0.032 5 mg，葉酸 folic acid 1.25 mg，煙酸 nicotinic acid 50 mg，泛酸 pantothenic 12 mg，Cu (as copper sulfate) 8 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 75 mg，Zn (as zinc sulfate) 75 mg，Mn (as manganese sulfate) 100 mg，Se (as sodium selenite) 0.15 mg，I (as potassium iodide) 10.35 mg。

2)代謝能為計算值，其余為實測值。ME was a calculated value, and the others were measured values.

1.4.3 腸道菌群數(shù)量

無菌稱取1 g回腸和盲腸內(nèi)容物，按文獻[9]采用平板活菌計數(shù)法測定腸道大腸桿菌和乳桿菌的數(shù)量。

1.4.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)檢測盲腸菌群多樣性

無菌稱取200 mg盲腸內(nèi)容物，按文獻[9]采用PCR-DGGE技術(shù)分析肉雞盲腸菌群多樣性。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行處理，初步計算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差后，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進行方差分析，差異顯著者采用Duncan氏法進行多重比較，差異顯著水平為P<0.05，試驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組枯草芽孢桿菌SE1對肉雞生長性能的影響

試驗期間未出現(xiàn)雞只死亡情況。由表2可知，與A組相比，C組肉雞的終末體重和平均增重分別增加6.14%和6.76%，但差異不顯著(P>0.05)；C組肉雞的料重比與A組相比降低8.21%，與B組相比降低6.28%，但差異均不顯著(P>0.05)。

表2 重組枯草芽孢桿菌SE1對肉雞生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 重組枯草芽孢桿菌SE1對肉雞腸道消化酶活性的影響

由表3可知，28日齡時，B組和C組肉雞的空腸脂肪酶和回腸蛋白酶活性顯著高于A組(P<0.05)；42日齡時，B組和C組肉雞的空腸脂肪酶、蛋白酶和回腸蛋白酶活性顯著高于A組(P<0.05)。B組肉雞的腸道消化酶活性與C組相比無顯著差異(P>0.05)。

表3 重組枯草芽孢桿菌SE1對肉雞腸道消化酶活性的影響

2.3 重組枯草芽孢桿菌SE1對肉雞腸道菌群數(shù)量的影響

由表4可知，28日齡時，B組和C組肉雞的回腸、盲腸大腸桿菌數(shù)量顯著低于A組(P<0.05)，盲腸乳桿菌數(shù)量顯著高于A組(P<0.05)；42日齡時，B組和C組肉雞的回腸、盲腸大腸桿菌數(shù)量顯著低于A組(P<0.05)，乳桿菌數(shù)量顯著高于A組(P<0.05)。

表4 重組枯草芽孢桿菌SE1對肉雞腸道菌群數(shù)量的影響

2.4 重組枯草芽孢桿菌SE1對肉雞盲腸菌群多樣性的影響

由圖1可知，B組和C組肉雞的盲腸菌群條帶數(shù)多于A組，亮度高于A組，B組和C組出現(xiàn)了較多的特異性條帶。由表5可知，B組和C組肉雞的盲腸菌群豐富度、均勻度和香農(nóng) 維納指數(shù)均顯著高于A組(P<0.05)。由圖2可知，28日齡時，A組、B組、C組肉雞盲腸菌群組內(nèi)的相似性分別為64.1%、96.2%、90.9%，A組與C組間的菌群相似性為64.1%，B組和C組間的菌群相似性為90.9%；42日齡時，A組、B組、C組組內(nèi)的菌群相似性分別為79.1%、94.7%、94.7%，A組與C組間的菌群相似性為79.1%，B組和C組間的菌群相似性達94.7%。

肉雞盲腸菌群16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE指紋圖譜中共選擇了27個條帶進行割膠回收(圖1箭頭所指)，除去6條重復(fù)條帶，其中有12條共性條帶，9條特性條帶，測序后在GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST比對，結(jié)果見表6。這些測序條帶主要為乳桿菌屬、梭菌屬、糞球菌屬、真桿菌屬、瘤胃球菌屬、厭氧醋菌屬、解纖維素菌屬、硫桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬的細菌。A組特有條帶為規(guī)則糞球菌；B組和C組特有條帶為甲基戊糖梭菌、嗜酸乳桿菌、液化沙雷氏菌、白色瘤胃球菌、糖丁基梭菌、嗜酸性硫酸鹽還原菌、嗜硫桿菌、羅氏乳桿菌。

3 討 論

3.1 重組枯草芽孢桿菌SE1對肉雞生長性能的影響

張曉云等[10]研究表明，枯草芽孢桿菌可提高肉雞的日增重和采食量，降低料重比。本研究表明，與對照組相比，飼糧中添加重組枯草芽孢桿菌SE1可增加肉雞的終末體重和平均增重，降低料重比。研究也表明，枯草芽孢桿菌能夠改善動物的消化機能，提高飼料利用率，促進動物生長[11-12]。Bai等[13]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂枯草芽孢桿菌可增加肉雞的日增重，這可能是由于枯草芽孢桿菌能夠通過分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶及多種維生素、生長因子和氨基酸來提高肉雞的腸道消化功能，促進機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[14]。劉瑞瑞[15]研究表明，雞口服禽流感重組枯草芽孢桿菌能顯著增強雞的全身性免疫水平，極顯著增加雞的小腸絨毛高度；其對雞體重的提高作用優(yōu)于正?？莶菅挎邨U菌。本試驗研究表明，與枯草芽孢桿菌168相比，重組枯草芽孢桿菌SE1組肉雞的終末體重和平均增重增加，料重比降低，但差異均不顯著?？赡苁怯捎谥亟M枯草芽孢桿菌SE1增加了機體的免疫功能，改善了小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，尤其是影響了腸絨毛的生長和發(fā)育，進而間接影響了機體的生長性能[16]；而差異不顯著可能是由于本試驗飼養(yǎng)條件以及肉雞品種較好，所以重組枯草芽孢桿菌SE1對肉雞生長性能的作用效果與枯草芽孢桿菌168相比無顯著差異。郭曉敏[17]研究表明，在攻毒前，飼喂雞白痢沙門菌OmpC-DC重組乳酸菌對雞體重的影響與乳酸菌組和對照組相比無顯著差異，與本試驗結(jié)果相一致。

1～3、4～6、7～9分別為28日齡時A、B、C組樣品；10～12、13～15、16～18分別為42日齡時A、B、C組樣品；19、20、21分別為28日齡時A組、B組、C組混合樣品；22、23、24分別為42日齡時A組、B組、C組混合樣品。下圖同。

1 to 3, 4 to 6 and 7 to 9 were the samples in groups A, B and C at 28 days of age, respectively; 10 to 12, 13 to 15 and 16 to 18 were the samples in groups A, B and C at 42 days of age, respectively; 19, 20 and 21 were the mixed samples in groups A, B and C at 28 days of age, respectively; 22, 23 and 24 were the mixed samples in groups A, B and C at 42 days of age, respectively. The same as below.

圖1 肉雞盲腸菌群PCR-DGGE指紋圖譜

A：28日齡；B：42日齡。

A: 28 days of age; B: 42 days of age.

圖2 肉雞盲腸菌群PCR-DGGE指紋圖譜聚類結(jié)果

3.2 重組枯草芽孢桿菌SE1對肉雞腸道消化酶活性的影響

動物腸道消化酶主要包括淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等，機體的生長代謝與消化酶活性的高低密切相關(guān)。Zokaeifar等[18]給南美白對蝦飼喂枯草芽孢桿菌8周后，發(fā)現(xiàn)試驗組的腸道蛋白酶和淀粉酶活性顯著高于對照組。卞國順等[19]研究報道，飼糧中添加105CFU/g枯草芽孢桿菌可顯著提高嶺南黃羽肉雞的空腸胰蛋白酶和淀粉酶活性，但脂肪酶活性顯著降低。劉清華等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂枯草芽孢桿菌可顯著提高鰻鱺消化道中蛋白酶和淀粉酶活性。本試驗中，飼喂重組枯草芽孢桿菌SE1可顯著提高肉雞的空腸脂肪酶和回腸蛋白酶活性，與以上研究結(jié)果相一致，這與枯草芽孢桿菌具有產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等消化酶的特性密切相關(guān)[21-22]；但腸道淀粉酶活性并未顯著提高，與上述研究略有不同，這可能是由于枯草芽孢桿菌分泌的酶抑制了內(nèi)源淀粉酶的活性，還可能是由于試驗條件和試驗動物種類不盡相同所致。而重組枯草芽孢桿菌SE1組肉雞的腸道消化酶活性與枯草芽孢桿菌168組相比無顯著差異，說明二者均能提高肉雞的腸道消化酶活性，枯草芽孢桿菌芽孢衣殼表面在展示雞白痢沙門氏菌外膜蛋白OmpC后，并不會影響其提高腸道消化酶活性的功能。

3.3 重組枯草芽孢桿菌SE1對肉雞腸道菌群的影響

研究證實，枯草芽孢桿菌能夠維持動物腸道微生態(tài)平衡，增加腸道菌群多樣性[23-25]。裴躍明等[26]發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加枯草芽孢桿菌能顯著降低蛋雞的盲腸大腸桿菌數(shù)量，增加乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量。Park等[27]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂枯草芽孢桿菌能顯著增加肉雞盲腸的乳桿菌數(shù)量，降低沙門氏菌數(shù)量。Gao等[28]試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加枯草芽孢桿菌可顯著降低肉雞的盲腸大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量，增加乳酸菌數(shù)量。這主要是因為：1)枯草芽孢桿菌孢子進入動物腸道后，迅速萌發(fā)成繁殖體，通過生物奪氧造成腸道厭氧環(huán)境，有利于厭氧菌的生長[29]；2)產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和乳酸等有機酸，降低腸道pH，從而抑制致病菌生長[30]；3)枯草芽孢桿菌能分泌多種具有拮抗作用的多肽[31]。本試驗中，飼糧中添加重組枯草芽孢桿菌SE1可使肉雞的回腸和盲腸大腸桿菌數(shù)量顯著減少，盲腸乳桿菌數(shù)量顯著增加，與以上研究結(jié)果相一致。

腸道菌群的豐富度提示腸道菌群種類多樣，均勻度和香農(nóng) 維納指數(shù)提示腸道菌群的均勻分配，種類越多，分配越均勻，環(huán)境越穩(wěn)定，三者在一定程度上能夠提示腸道微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性[32-33]。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加重組枯草芽孢桿菌SE1，肉雞盲腸菌群的豐富度、均勻度和香農(nóng) 維納指數(shù)均顯著高于對照組。重組枯草芽孢桿菌SE1組肉雞的盲腸菌群組內(nèi)的相似性顯著高于對照組，其中28日齡時高26.8%，42日齡時高15.6%；而與枯草芽孢桿菌168組相比，相似性達到90%以上。PCR-DGGE指紋圖譜結(jié)果顯示，重組枯草芽孢桿菌SE1組的特異性條帶數(shù)與枯草芽孢桿菌168組完全相同，多于對照組。測序條帶以梭菌屬和乳桿菌屬等有益菌為主，說明重組枯草芽孢桿菌SE1能夠提高肉雞的盲腸菌群多樣性，維持腸道菌群的穩(wěn)定性，與趙秀英等[34]、Wang等[35]、朱沛霽[36]的報道結(jié)果相一致。但重組枯草芽孢桿菌SE1組和枯草芽孢桿菌168組中均出現(xiàn)了條件致病菌液化沙雷氏菌，該菌是否對肉雞存在致病作用以及存在的原因，有待進一步研究。

本試驗中，飼糧中添加重組枯草芽孢桿菌SE1和枯草芽孢桿菌168對肉雞盲腸菌群數(shù)量及菌群多樣性的影響基本一致，無顯著性差異。但劉明剛等[8]研究表明，重組枯草桿菌芽孢經(jīng)口服免疫可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性血清IgG和腸黏膜SIgA抗體，并可賦予小鼠抗鼠傷寒沙門氏菌感染的交叉保護作用。劉瑞瑞[15]研究發(fā)現(xiàn)，雞口服禽流感重組枯草芽抱桿菌能夠顯著提高局部黏膜體液特異性SIgA和血清特異性IgG含量。郭曉敏[17]研究表明，飼糧中添加雞白痢沙門菌OmpC-DC重組乳酸菌，雞血清IgG和腸內(nèi)容物SIgA含量顯著增加。結(jié)合本試驗結(jié)果，說明重組枯草芽孢桿菌SE1可以在不改變枯草芽孢桿菌168益生效果的基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫保護作用，并對異源沙門氏菌感染提供交叉保護作用，這也為枯草芽孢桿菌進一步開發(fā)利用和新型沙門氏菌疫苗的研發(fā)提供了新的思路。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加重組枯草芽孢桿菌SE1能提高肉雞的終末體重和平均增重，降低料重比，促進肉雞的生長性能；且與枯草芽孢桿菌168制劑效果相似。

② 飼糧中添加重組枯草芽孢桿菌SE1能顯著提高肉雞的空腸脂肪酶和回腸蛋白酶活性，但對淀粉酶活性無顯著影響；且與枯草芽孢桿菌168制劑效果相似。

③ 飼糧中添加重組枯草芽孢桿菌SE1能顯著降低肉雞回腸、盲腸大腸桿菌數(shù)量，增加乳桿菌數(shù)量，顯著提高盲腸菌群多樣性和穩(wěn)定性；且與枯草芽孢桿菌168制劑效果相似。

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