吳學壯 楊 穎 劉 志 高秀華* 楊福合 楊培龍 邢秀梅

(1.安徽科技學院動物科學學院，蚌埠 233100；2.中國農業(yè)科學院飼料研究所，農業(yè)部飼料生物技術重點實驗室，北京 100081；3.中國農業(yè)科學院特產研究所，長春 130112)

銅是動物必需的微量元素，在動物能量代謝、血紅蛋白(hemoglobin，Hb)合成和脂肪代謝等生理過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。銅缺乏會影響動物對鐵的吸收，進而影響造血功能[3-4]，而動物飼糧添加適宜的銅可以提高腸道脂肪酶的活性[5-7]，進而提高脂肪表觀消化率[8-11]。此外，大量研究表明，動物飼糧添加銅可以降低血漿總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)含量[12-14]。迄今為止，銅對畜禽生物學功能的研究有許多報道，而飼糧中添加銅對水貂脂質代謝、血紅蛋白合成及腸道消化酶活性的影響還鮮有報道。為此，本試驗以冬毛期水貂為試驗對象，通過在其飼糧中添加不同水平的銅，研究銅對冬毛期水貂血清脂類代謝指標、血液參數、腸道消化酶活性及膽汁微量元素含量的影響，旨在揭示銅對于促進和改善動物生長性能和脂類代謝調控的理論機制，為銅的合理應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養(yǎng)管理

試驗在農業(yè)部長白山野生生物資源重點野外科學觀測試驗站的毛皮動物生產基地展開。在毛皮動物生產基地隨機選擇健康、體重相近的(110±3)日齡水貂140只(公母各占1/2)。試驗采用單因素隨機試驗設計，將140只試驗水貂隨機分為7個組，每組20個重復，每個重復1只水貂。以五水合硫酸銅(CuSO4·5H2O)為銅源，各組水貂分別飼喂在基礎飼糧(銅含量為7.68 mg/kg)中添加0(對照組)、6(Cu6組)、12(Cu12組)、24(Cu24組)、(Cu48組)、96(Cu96組)和192 mg/kg(Cu192組)銅的試驗飼糧。預試期7 d，正試期90 d。

試驗水貂均單籠(40 cm×40 cm×60 cm)飼養(yǎng)，每日07:30與15:30各飼喂1次，自由采食，自由飲水，常規(guī)免疫。水貂目前沒有統(tǒng)一的飼養(yǎng)標準，參照國內近幾年水貂營養(yǎng)需要量的研究，配制冬毛期水貂基礎飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

1)每千克預混料含有 Contained the following per kg of the premix：維生素A醇 vitamin A retinol 1 000 000 IU，膽鈣化醇 cholecalciferol 200 000 IU，生育酚醋酸酯 tocopheryl acetate 6 000 IU，硫胺素 thiamine 600 mg，核黃素 riboflavin 800 mg，鈷胺素 cobalamin 10 mg，甲萘醌 menadione 100 mg，抗壞血酸 ascorbic acid 40 000 mg，煙酸 nicotinic acid 4 000 mg，泛酸 pantothenic acid 1 200 mg，生物素 biotin 20 mg，葉酸 folic acid 80 mg，膽堿 choline 30 000 mg，Fe 8 200 mg，Mn 1 200 mg，Zn 5 200 mg，I 50 mg，Se 20 mg，Co 50 mg。

2)代謝能為計算值，其他營養(yǎng)水平為實測值。ME was a calculated value, while the other nutrient levels were measured values.

1.2 樣品采集

血液樣品采集：飼養(yǎng)試驗結束后，每組分別選取16只水貂，趾尖采血8～10 mL，置于促凝采血管和抗凝采血管各1/2。轉移至實驗室，3 500 r/min，4 ℃離心10 min，將分離出的血清分裝在1.5 mL的Eppendor管中，置于-80 ℃中保存，備用。

組織器官樣品采集：飼養(yǎng)試驗結束后，每組分別選取水貂16只，首先空腹稱重，之后各組水貂飼喂相應飼糧，60 min后，注射氯化琥珀膽堿處死，迅速解剖，分別取大約10 cm左右空腸和回腸，將用細線扎住腸道兩端，投入液氮中速凍，隨后從液氮中迅速取出，用解剖剪剪開腸段刮取腸道食糜于凍存管中，轉入-80 ℃冰箱冷藏，待測腸道食糜胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 血清脂類代謝指標

采用磷酸甘油氧化酶-過氧化物酶(GPO-PAP)法檢測血清TG含量，采用膽固醇氧化酶-過氧化物酶(COD-PAP)法檢測血清TC含量，采用選擇性清除法測定低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)含量。以上指標均用試劑盒測定，試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司。

1.3.2 血液參數

血紅蛋白含量測定：采用氰化高鐵(HICN)比色法測定血液血紅蛋白含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

血細胞比容測定：采用溫氏法測定血細胞比容。

1.3.3 腸道消化酶活性

未解凍前稱取定量(0.5～1.0 g)的腸道食糜內容物，按質量體積比1∶9加入0.86%的生理鹽水，勻漿粉碎，低溫離心機離心2 500 r/min，離心10 min，取上清液。按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書操作，用SPECORD 50紫外光分光光度計測定吸光度，計算胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。

1.3.4 膽汁微量元素含量

用移液器取2 mL膽汁樣品于100 mL錐形瓶中，加10 mL優(yōu)級純硝酸，封口放置2 h，置于電爐上低溫消煮至近干，將溶液無損失地轉移到10 mL容量瓶中，使用VARIAN SpectrAA-240原子吸收分光光度計進行銅、鋅、錳和鐵含量的測定。

1.4 數據分析

試驗數據采用SAS 9.13軟件GLM程序進行統(tǒng)計分析，性別差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行顯著性檢驗，組間差異采用Duncan氏法多重比較進行顯著性檢驗；采用SAS 9.13軟件REG程序，以飼糧銅水平為自變量，各種指標為效應因子，進行線性和二次曲線回歸分析。其中P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 飼糧銅水平對冬毛期水貂血清脂類代謝指標的影響

飼糧銅水平對冬毛期水貂血清脂類代謝指標的影響見表2。雄性水貂血清TC(線性，P<0.01；二次，P<0.05)和TG(線性，P<0.01；二次，P<0.01)含量隨飼糧銅水平的增加呈線性或二次曲線降低。飼糧銅水平對雄性水貂血清HDL-C和LDL-C含量影響不顯著(P<0.05)。對照組雄性水貂血清TC含量顯著高于Cu96和Cu192組(P<0.05)；對照組雄性水貂血清TG含量極顯著高于其他各組(P<0.01)，且其他各組之間差異不顯著(P>0.05)；各組之間雄性水貂血清HDL-C和LDL-C含量差異不顯著(P>0.05)。

雌性水貂血清TC含量隨飼糧銅水平的增加呈線性和二次曲線降低(P<0.01)，雌性水貂血清HDL-C含量與飼糧銅水平呈線性升高(P<0.05)。飼糧銅水平對雌性水貂血清TG和LDL-C含量影響不顯著(P>0.05)。對照、Cu6和Cu12組雌性水貂血清TC含量極顯著高于Cu96和Cu192組(P<0.01)；對照和Cu6組雌性水貂血清TC含量顯著高于Cu48組(P<0.05)；Cu6組雌性水貂血清TG含量顯著高于Cu48組(P<0.05)，其他各組之間差異不顯著(P>0.05)；對照組雌性水貂血清LDL-C含量顯著高于Cu48組(P<0.05)，其他各組之間差異不顯著(P>0.05)。雄性水貂的血清TC和TG含量顯著高于雌性水貂(P<0.05)。

2.2 飼糧銅水平對冬毛期水貂血液參數的影響

飼糧銅水平對冬毛期水貂血液參數的影響見表3。飼糧銅水平對水貂血紅蛋白含量和血細胞比容無顯著影響(P>0.05)，雄性水貂水貂血紅蛋白含量和血細胞比容與雌性水貂無顯著差異(P>0.05)。

2.3 飼糧銅水平對冬毛期水貂腸道消化酶活性的影響

飼糧銅水平對冬毛期水貂腸道消化酶活性的影響見表4。飼糧銅水平對水貂空腸和回腸消化酶活性均無顯著影響(P>0.05)。雄性水貂空腸、回腸胰蛋白酶活性和空腸淀粉酶活性極顯著高于雌性水貂(P<0.01)，雄性水貂空腸脂肪酶活性顯著高于雌性水貂(P<0.05)。

2.4 飼糧銅水平對冬毛期水貂膽汁微量元素含量的影響

飼糧銅水平對冬毛期水貂膽汁微量元素含量的影響見表5。水貂膽汁銅含量隨飼糧銅水平的增加呈線性增加(P<0.05)，水貂膽汁錳和鐵含量隨飼糧銅水平的增加呈線性或二次曲線降低(P<0.01)。

表2 飼糧銅水平對冬毛期水貂血清脂類代謝指標的影響

同一項目同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same column and the same item, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 飼糧銅水平對冬毛期水貂血液參數的影響

續(xù)表3項目Items血紅蛋白Hb/(g/L)血細胞比容Hematocrit/%SEM1.380.10P值P-value線性Linear0.41240.9415二次Quadratic0.69100.9543雌性Female組別Groups對照Control217.454.91Cu6220.555.06Cu12218.555.20Cu24223.154.83Cu48224.355.20Cu96221.855.11Cu192221.855.09SEM1.380.10P值P-value線性Linear0.32700.7457二次Quadratic0.19040.8847雄性Male222.354.94雌性Female221.055.06

表4 飼糧銅水平對冬毛期水貂腸道消化酶活性的影響

續(xù)表4項目Items空腸Jejunum胰蛋白酶Trypsin/(U/mgprot)脂肪酶Lipase/(U/gprot)淀粉酶Amylase/(U/mgprot)回腸Ileum胰蛋白酶Trypsin/(U/mgprot)脂肪酶Lipase/(U/gprot)淀粉酶Amylase/(U/mgprot)P值P-value線性Linear0.7100.5460.6060.7190.5220.409二次Quadratic0.9240.4730.7270.9320.4420.663雄性Male8913A4705a572.8A8243A3834439.7雌性Female8464B4559b548.1B7746B3722438.6

表5 飼糧銅水平對冬毛期水貂膽汁微量元素含量的影響

-:未檢出 not detected。

3 討 論

3.1 飼糧銅水平對水貂血清脂類代謝指標的影響

大量研究表明，銅與血液脂類代謝存在密切相關性，動物飼糧添加銅能夠影響動物體內脂類代謝，主要體現為飼糧添加銅可以降低血漿TC和TG水平[13-14]。但是，銅對動物體內脂類代謝的內在機制并不清楚，有待進一步研究。動物體內膽固醇主要由肝臟合成，部分來自食物。3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶是肝細胞合成膽固醇過程中的限速酶[15]，Kim等[16]研究發(fā)現，飼喂低銅水平飼糧時，小鼠肝臟細胞中HMG-CoA還原酶活性增加，膽固醇7α-羥化酶是在肝臟合成并促使膽固醇轉化成膽酸的限速酶[17]。Tang等[18]研究表明，成年大鼠飼喂低銅水平飼糧時，膽固醇7-α羥化酶基因相對表達量降低80%，膽固醇7α-羥化酶活性降低，膽固醇轉化發(fā)生障礙，導致高膽固醇血癥。本研究結果表明，隨飼糧銅水平的增加，血清中TC、TG和LDL-C含量都呈現降低的趨勢，而飼糧銅水平沒有影響血清HDL-C含量。

血清TC含量受年齡、性別、飲食等多種因素的影響，一般而言，雄性動物高于雌性動物。本研究結果顯示，雄性水貂的血清TC和TG含量顯著高于雌性水貂，其原因可能是由于冬毛期雄性水貂皮下脂肪和體重均高于雌性水貂。此外，水貂為嚴格的肉食性動物，血清TC含量高于人類和豬、牛、羊等動物。

3.2 飼糧銅水平對水貂血液參數的影響

銅在血液中主要以紅細胞銅藍蛋白和血漿銅藍蛋白2種形式存在[19]。銅藍蛋白可促使三價鐵變?yōu)槎r鐵，促進胃腸道對鐵的吸收，促進血紅蛋白和卟啉合成[3-4]，此外，銅還可以促進幼稚紅細胞的成熟和釋放[3]。動物體內銅缺乏時，血漿銅藍蛋白的活性降低，從而導致鐵的價位轉變發(fā)生障礙而引起貧血，血紅蛋白合成受阻，鐵代謝紊亂及紅細胞減少，形成“低血銅癥”(hypocupremia)[20]。本研究發(fā)現，飼糧銅水平對水貂血紅蛋白含量和血細胞比容沒有顯著影響，這與Aulerich等[21]的研究結果相似。本研究結果表明，水貂飼喂基礎飼糧，并未造成水貂銅的嚴重缺乏而引起血紅蛋白含量和血細胞比容的改變。此外，水貂血紅蛋白含量和血細胞比容性別差異不顯著。

3.3 飼糧銅水平對水貂腸道消化酶活性的影響

大量研究表明，動物飼糧添加銅可以提高腸道脂肪酶的活性[5-7]，進而提高脂肪表觀消化率[8-11]。動物腸道消化酶活性提高直接提高動物對營養(yǎng)物質的消化率，進而改善生長性能[6]。本研究結果表明，飼糧銅水平對水貂空腸和回腸胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均無影響，但是脂肪酶活性隨飼糧銅水平呈先增加后降低的趨勢。分析其原因，可能由于水貂飼喂低銅水平的糧時提高了腸道脂肪酶活性，而水貂飼糧銅水平過高可導致銅中毒，進而導致腸道脂肪酶活性降低。影響動物腸道消化酶活性的因素很多，包括種間差異、生長階段、飼糧組成和環(huán)境溫度等[22]。

本研究結果表明，雄性水貂空腸胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性顯著高于雌性水貂。前期研究結果表明，雄性水貂對粗蛋白質和粗脂肪消化率高于雌性水貂，得到客觀證實。但是性別對水貂腸道消化酶活性影響的內在機制并不清楚，有待進一步研究。

3.4 飼糧銅水平對水貂膽汁微量元素含量的影響

膽汁是內源性銅的主要排泄途徑之一[23-24]。研究表明，隨著飼糧銅水平增加，膽汁銅含量有所升高，但是卻沒有成倍增加，然而膽汁鐵、錳和鋅含量卻成倍降低。關于飼糧銅水平對膽汁鐵、錳和鋅含量影響的研究還處于空白。結合本研究結果推斷，水貂飼喂不同銅水平的飼糧可以增加膽汁分泌量，從而導致膽汁鐵、錳和鋅含量降低。Czarnecki等[25]報道，飼糧銅水平低于250 mg/kg時，膽汁中銅含量不會增加；飼糧銅水平高于250 mg/kg時，膽汁中銅含量才會增加。Armstrong等[26]研究表明，飼糧添加225 mg/kg銅(硫酸銅)時，動物的膽汁銅含量較高；而與對照組相比，飼糧添加低水平(33、66、100 mg/kg)的銅卻沒有引起膽汁銅含量的升高。

4 結 論

① 隨飼糧銅水平的增加，血清中TC、TG和LDL-C含量都呈現降低的趨勢，而飼糧銅水平沒有影響血清HDL-C含量。

② 飼糧銅水平沒有影響水貂血紅蛋白含量和血細胞比容的改變。

③ 水貂空腸和回腸脂肪酶活性有隨飼糧銅水平先增加后降低的趨勢。

④ 水貂血清脂類代謝指標和腸道消化酶活性存在性別差異，雄性水貂血清TC、TG含量和空腸胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性顯著高于雌性水貂。

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