張雪嬌 王立志

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，成都 611130)

在反芻動物飼糧中，纖維成分占有很大的比重。它在促進瘤胃蠕動，維持瘤胃正常酸堿環(huán)境等方面有著不可替代的作用。以往雖然許多學者都曾研究過纖維的生理功能，但是對纖維的定義并不科學也不統(tǒng)一?，F(xiàn)在人們普遍認為，相比其他纖維指標而言，中性洗滌纖維(NDF)是表示動物飼糧纖維水平最好的指標，因為它幾乎涵蓋了組成纖維的所有成分[1]。NDF不僅具有維護動物胃腸道健康的作用，其降解產(chǎn)物還為動物的生長發(fā)育提供了大量能量。但反芻動物本身并不具有消化NDF的能力，其對纖維的利用主要依賴于瘤胃內(nèi)寄生的微生物。瘤胃微生物的結(jié)構(gòu)與組成決定了宿主對NDF的消化利用程度，而宿主進食的NDF也是瘤胃微生物賴于生長繁殖的重要底物。以往雖然已有飼糧纖維水平對瘤胃微生物影響的研究，但這些研究主要采用的是傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)和變性梯度電泳等指紋圖譜技術(shù)[2-6]。培養(yǎng)技術(shù)只能分析能在體外培養(yǎng)基中生長的微生物，但瘤胃中99%左右的微生物到目前為止還不能進行體外培養(yǎng)。而指紋圖譜技術(shù)不僅費時費力，且分辨率低，僅能檢測出樣品中10%左右的優(yōu)勢微生物。這些技術(shù)都嚴重低估了瘤胃微生物的多樣性，因此飼糧NDF水平影響瘤胃微生物結(jié)構(gòu)與組成的規(guī)律還不盡為人所知。針對這些問題，本研究擬采用最新的Illumina HiSeq 250PE高通量測序技術(shù)，全面揭示飼糧NDF水平對山羊瘤胃細菌結(jié)構(gòu)與組成的影響，研究結(jié)果能提高人們對瘤胃微生物適應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)水平變化規(guī)律的認識，以及營養(yǎng)物質(zhì)水平對瘤胃微生物多樣性的影響等知識的理解，還可為今后通過調(diào)控瘤胃微生物促進瘤胃纖維的降解提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理

試驗動物為6只健康雄性努比亞黑山羊，平均月齡為8月齡，平均體重為(28.33±3.77) kg。參照我國《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T 816—2004)，以每天每頭增重0.1 kg為標準配制各組飼糧。采用3×3拉丁方試驗，依據(jù)飼糧NDF水平分為低(35.01%，LN組)、中(40.10%，MN組)和高NDF水平組(45.16%，HN組),每組2只。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。飼糧中的干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)、鈣(calcium，Ca)、磷(phosphorus，P)等常規(guī)營養(yǎng)成分參照Chemists[7]的方法進行測定，NDF和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量參照Van Soest等[8]的方法進行測定。試驗羊單欄飼養(yǎng)，每天分別于09:00及17:00分2次飼喂，自由飲水。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項目Items組別GroupsLNMNHN代謝能ME/(MJ/kg)8.838.838.82中性洗滌纖維NDF35.0140.1045.16酸性洗滌纖維ADF17.3920.3222.41鈣Ca0.740.740.74磷P0.440.440.44精粗比Concentratetoforageratio49.50∶50.5048.09∶51.9136.62∶63.38

1)預混料為每千克飼糧提供The premix provides the following per kg of diets：VA 2 200 IU，VD 250 IU，VE 20 IU，F(xiàn)e 40 mg，Cu 10 mg，Mn 40 mg，Zn 30 mg，Se 0.2 mg，I 0.8 mg，Co 0.11 mg。

2)代謝能是采用我國《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T 816—2004)飼料成分表中的數(shù)據(jù)計算所得,其余為實測值。ME is calculated using the data in feed composition table from ChineseFeedingStandardofMeat-ProducingSheepandGoat(NY/T 816—2004), while other nutrient levels are measured values.

1.2 試驗設(shè)計及樣品采集

分3期進行飼養(yǎng)試驗，每期試驗20 d，其中預試期14 d，正試期6 d。參照文獻[9]中的方法，每期飼養(yǎng)試驗結(jié)束后于次日晨飼后2 h，將10 mm直徑塑料管連接到真空泵，用開口器打開羊的口腔，將塑料管從羊口腔緩慢插入至瘤胃，抽取瘤胃內(nèi)容物約50 mL，用便攜式酸度計進行瘤胃液pH測定后，立即裝入充滿氮氣的樣品袋中，置于冰上。反復拍打樣品袋以確保固相微生物充分進入液相，然后用4層紗布過濾得到瘤胃液，迅速投入液氮罐中，立即帶回實驗室轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 瘤胃發(fā)酵參數(shù)檢測

瘤胃液氨態(tài)氮(NH3-N)濃度的測定：參照Broderick等[10]描述的方法進行測定。首先將采集的瘤胃內(nèi)容物進行預處理；然后制作NH3-N標準曲線，建立線性擬合回歸方程；接著把預處理后的待測離心瘤胃液充分混勻，再吸取80 μL加入到預先標好的測試管中，各管按照補加試劑順序依次加入40 μL甲醇、2.5 mL苯酚、2.0 mL堿性次氯酸鈉溶液，在37 ℃水浴10 min，取出后室溫下放置10 min，于650 nm處采用酶標儀(美國Molecular Devices公司SpectramaxM2)測定吸光度值；最后將樣品液的吸光度值代入線性擬合回歸方程，計算出瘤胃液中NH3-N濃度。

瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度的測定：參照Li等[11]描述的方法采用氣相色譜分析儀(CP-3800，美國Varian公司)進行測定。首先將采集的瘤胃內(nèi)容物進行預處理；然后向標準中間液中分別加入0.2 mL偏磷酸溶液，40 μL巴豆酸溶液，混勻，4 ℃放置30 min,12 000×g離心10 min，接著取上清液0.1 mL加入0.9 mL甲醇，混勻后經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾。用氣相色譜分析儀對濾液中乙酸、丙酸、丁酸的含量進行測定。

1.4 總DNA的提取和高通量測序

取200 μL瘤胃液樣品，用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的糞便基因組DNA提取試劑盒提取瘤胃細菌總DNA。采用細菌通用引物對(515F:GTGCCAGCMGCCGCGGTAA；806R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT)[12]，以提取的總DNA為模板針對細菌16S rRNA V4區(qū)域進行PCR擴增。采用如下50 μL反應(yīng)體系：dNTP Mixture (10 mmol/L) 1 μL，上游、下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL，總DNA(50 ng/μL) 1 μL，Taq DNA Polymerase(5 U/μL,含Mg2+) 0.25 μL，10×Taq Buffer 5 μL，加雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)如下：95 ℃預變性2 min；隨后變性循環(huán)30次(95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s)；72 ℃延伸5 min，10 ℃冷卻。PCR產(chǎn)物待檢測合格后送北京諾禾致源生物科技有限公司，采用Illumina HiSeq 250 PE平臺進行高通量測序。

1.5 生物信息學分析

參照Wright等[13]的方法，利用QIIME 1.8.0軟件對測序原始數(shù)據(jù)進行初次質(zhì)控，過濾掉低質(zhì)量序列，去除Barcode和引物序列，然后參照Yez-Ruiz等[14]的方法，在Mothur軟件中進行拼接；再在QIIME 1.8.0軟件中使用Uparse模塊將拼接的序列按97%的相似性聚類為運算分類單位(operational taxonomic unit,OTU)，并挑選每個OTU中相對豐度最高的序列作為代表序列。將代表序列與RDP數(shù)據(jù)庫(Release 11.1，http://rdp.cme.msu.edu/)比對并構(gòu)建OTU表，用RDP Classifier將OTU代表性序列在微生物各分類水平進行物種注釋，并繪制在門水平物種組成的柱狀圖?；谌コ逗象w和Singletons處理之后的OTU table、rep_set.tree文件及其抽樣最大深度，計算α-多樣性指數(shù)(Chao1、Shannon、observed species)并繪制各樣品的OTU稀釋曲線。對樣品共享屬進行分析，用R軟件根據(jù)共享屬的組成及其在各樣品中所占的比例，繪制樣品間共享屬的聚類熱圖。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果用以下一般線性模型表示：

Yij(k)=μ+αi+βj+γ(k)+ij(k)(i=1,2,3;j=1,2,3;k=1,2,3)。

式中：Y為某指標的觀測值;μ為試驗全部觀測值總體平均值；α、β、γ分別為本研究中試驗期、羊組別和飼糧NDF水平;為隨機誤差。

用SPSS 21.0軟件中的ANOVA模塊用以NDF水平為主要影響因素，且與其他2個影響因素無互作效應(yīng)的方法對組間進行差異顯著性檢驗，并用Duncan氏法進行多重比較。試驗結(jié)果以平均值±標準差表示。以P<0.05表示差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧NDF水平對山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

從表2可以看出，山羊瘤胃液pH在3組間差異不顯著(P>0.05)，但隨著飼糧NDF水平的增加有升高趨勢；HN組瘤胃液NH3-N濃度極顯著低于LN組和MN組(P<0.01)，LN組和MN組間的差異不顯著(P>0.05)；各組間瘤胃液乙酸、丙酸、丁酸及總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度差異均不顯著(P>0.05)，乙酸/丙酸有隨著飼糧NDF水平增加而升高的趨勢，且LN組和HN組間的差異達到了顯著水平(P<0.05)。

表2 飼糧NDF水平對山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2 飼糧NDF水平對山羊瘤胃細菌結(jié)構(gòu)及組成的影響

2.2.1 各樣品測序深度和OTU數(shù)量分析

本次試驗共得到了1 125 746條有效序列(clean data)，平均每個樣品含(62 541±9 024)條。將有效序列進行聚類，共得到17 198個OTU。3組間共享OTU數(shù)為1 012個，LN組與MN組間共享OTU數(shù)為1 197個，LN組與HN組間共享OTU數(shù)為1 083個，MN組與HN組間共享OTU數(shù)為1 083個(圖1)。

2.2.2 樣品稀釋曲線和α-多樣性分析

各樣品的稀釋曲線見圖2。由圖可見，在本試驗的測序深度下(reads=30 154)，各樣品稀釋曲線最終均趨于平緩可以，說明本試驗的測序深度覆蓋各樣品的絕大多數(shù)微生物。

在取樣深度為30 154時對山羊瘤胃細菌的α-多樣性指數(shù)進行組間差異分析，結(jié)果見表3。Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)在組間差異均不顯著(P>0.05)，LN組observed species指數(shù)顯著高于其他2組(P<0.05)，其他2組間則無顯著差異(P>0.05)。

圖1 OTU維恩圖

2.2.3 瘤胃細菌結(jié)構(gòu)及組成

將本試驗所得有效序列在不同分類水平上進行物種注釋，結(jié)果共得到23個門，44個綱，71個目，121個科，225個屬。由圖3可以看出，在門水平上，3組間物種相對豐度差異均不顯著(P>0.05)。擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)在3組中均為優(yōu)勢菌門，其次依次為黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、軟壁菌門(Tenericutes)。

在屬水平上，3組的前2個優(yōu)勢屬均依次為普雷沃氏菌屬1(Prevotella1)和理研菌屬RC9(RikenellaceaeRC9gutgroup)。將225個屬中相對豐度低于1%的屬聚為其他(215個)后，各樣本在屬水平上的物種組成見圖4。表4列出了在屬水平上組間相對豐度有顯著差異的細菌。普雷沃氏菌科UCG-001(PrevotellaceaeUCG-001)、普雷沃氏菌科UCG-003(PrevotellaceaeUCG-003)和瘤胃球菌科UCG-014(RuminococcaceaeUCG-014)的相對豐度呈現(xiàn)隨飼糧NDF水平增加而升高的變化規(guī)律，且HN組顯著高于其他2組(P<0.05)，其他2組間無顯著差異(P>0.05)；瘤胃球菌科NK4A214(RuminococcaceaeNK4A214group)、瘤胃球菌科UCG-005(RuminococcaceaeUCG-005)的相對豐度呈現(xiàn)隨飼糧NDF水平增加而升高，且HN組顯著高于LN組(P<0.05)；SP3-e08和Lachnoclostridium10的相對豐度呈現(xiàn)隨NDF水平增加而降低的變化規(guī)律，且HN組顯著低于其他2組(P<0.05)，其他2組無顯著差異(P>0.05)；LN組中解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)的相對豐度顯著高于其他2組(P<0.05)，其他2組無顯著差異(P>0.05)；MN組中賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和葉桿菌屬(Phyllobacterium)的相對豐度顯著高于其他2組(P<0.05)，食物谷菌屬(Victivallis)的相對豐度極顯著高于其他2組(P<0.01)，其他2組間無顯著差異(P>0.05)；LN組[Eubacterium]ruminantiumgroup的相對豐度顯著高于HN組(P<0.05)，但與MN組比較無顯著差異(P>0.05)。

圖例由組別和樣品編號構(gòu)成。

Legends consisted of group name and sample No.

圖2樣品的稀釋曲線

Fig.2 Rarefaction curves of samples

2.2.4 共享屬分析

經(jīng)統(tǒng)計，所有樣品間共有35個共享屬。其中，相對含量在1%以上的主要共享菌屬由高到低依次為Prevotella1[(37.29 ±7.27)%]、RikenellaceaeRC9gutgroup[(7.30±0.54)%]、PrevotellaceaeUCG-003[(2.31±0.88)%]、毛螺菌科ND3007(LachnospiraceaeND3007group)[(2.19±0.52)%]、PrevotellaceaeUCG-001[(2.04±0.93)%]、琥珀酸弧菌科UCG-002(SuccinivibrionaceaeUCG-002)[(1.90±1.75)%]、月形單胞菌屬1(Selenomonas1)[(1.79±4.24)%]、瘤胃球菌屬2(Ruminococcus2)[(1.35±1.77)%]、琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)[(1.20±0.58)%]、RuminococcaceaeUCG-014[(1.13±0.81)%]。這些菌屬的比例占總菌屬的56.50%。共享菌群在屬水平上的聚類熱圖見圖5。

表3 在取樣深度為30 154時各組α多樣性指數(shù)的對比

圖3 瘤胃細菌在門水平上的組成(相對豐度前10)

圖4 瘤胃細菌在屬水平上的組成

3 討 論

由于NDF具有調(diào)控和維持反芻動物瘤胃正常發(fā)酵的作用，所以不同飼糧NDF水平會影響瘤胃的發(fā)酵模式。那仁巴圖等[15]采用完全隨機試驗設(shè)計在6個飼糧NDF水平(49%、52%、55%、59%、62%和65%)下研究了內(nèi)蒙古白絨山羊羯羊的瘤胃發(fā)酵的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧NDF水平對瘤胃液pH、NH3-N濃度均有顯著影響，但對瘤胃液微生物蛋白(MCP)和乙酸、丙酸和丁酸濃度的影響不顯著。王海榮等[16]也分別在3個不同飼糧NDF水平(42.71%、54.59%、64.38%)下研究了蘇尼特綿羊瘤胃內(nèi)環(huán)境的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著NDF水平的增高，綿羊瘤胃液NH3-N濃度會顯著降低，瘤胃液乙酸/丙酸顯著升高，與本試驗結(jié)果相一致。

表4 各組相對豐度存在顯著差異的屬

圖5 共享菌群在屬水平上的聚類熱圖

本次研究發(fā)現(xiàn)RuminococcaceaeNK4A214group、RuminococcaceaeUCG-005和RuminococcaceaeUCG-014的相對豐度隨飼糧NDF水平增加而升高的變化規(guī)律。這些細菌都屬于瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)，以往的研究表明瘤胃菌科微生物與纖維降解密切相關(guān)，在瘤胃內(nèi)可產(chǎn)生纖維酶降解纖維二糖等纖維類物質(zhì)，是一類典型的纖維降解菌[17-18]。Patra等[19]的研究表明，瘤胃菌科的數(shù)量減少會導致纖維消化率降低。Zhao等[20]的研究也證實，瘤胃菌科的微生物與飼糧NDF的消化率顯著相關(guān)。本研究的結(jié)果表明，飼糧NDF水平的增加，山羊瘤胃菌科微生物的增殖加強，這可能是一種底物誘導效應(yīng)。這也從證實了瘤胃菌科與瘤胃纖維降解的密切關(guān)系。

本試驗中，PrevotellaceaeUCG-001和PrevotellaceaeUCG-003的相對豐度表現(xiàn)出隨飼糧NDF水平增加而升高的變化規(guī)律，說明飼糧NDF水平的提高也能促進這2種細菌的生長。導致這種現(xiàn)象的原因可能與這些細菌的特性有關(guān)。這2種細菌屬于普雷沃氏菌屬(Prevotella)，以往體外培養(yǎng)的試驗表明，它們具有消化蛋白質(zhì)和氨基酸的活性，沒有直接降解纖維的能力，但與纖維降解菌共培養(yǎng)時卻能間接地促進纖維的降解[21-23]。Zhao等[20]在犢牛上的試驗表明，飼糧纖維消化率的高低影響著這2種細菌的相對豐度，再結(jié)合本研究的結(jié)果可以推測，這2種細菌可能是重要的纖維降解協(xié)作菌，它們也可從纖維降解過程中獲取養(yǎng)分，從而導致本研究中HN組這2種細菌的相對豐度顯著高于其他2組。

本次研究還發(fā)現(xiàn)，解琥珀酸菌屬的相對豐度在組間存在著顯著差異。有研究報道，解琥珀酸菌屬能發(fā)酵降解纖維或纖維二糖產(chǎn)生琥珀酸、乙酸和二氧化碳等，也是一種典型的纖維降解菌[25]。國內(nèi)外許多學者的研究也發(fā)現(xiàn)，解琥珀酸菌屬和纖維降解有密切的關(guān)系[25-26]。而本課題組以往的研究結(jié)果也表明，纖維消化率高的山羊解琥珀酸菌屬的相對豐度顯著高于纖維消化率低的山羊。根據(jù)該菌的特性從理論上分析，當飼糧纖維含量增加時該菌的相對豐度應(yīng)升高。但本研究中，LN組的相對豐度卻顯著高于其他2組，造成這種現(xiàn)象的具體原因還不清楚，有可能與LN組飼糧中淀粉含量較高有關(guān)。淀粉是解琥珀酸菌屬最主要的底物，與纖維相比，淀粉更能刺激解琥珀酸菌屬的生長。

4 結(jié) 論

① 飼糧NDF水平在35.01%～45.16%變化時，隨NDF水平增加，瘤胃液NH3-N濃度降低,瘤胃液乙酸/丙酸升高。

② 山羊瘤胃的優(yōu)勢細菌是擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門。

③ 山羊瘤胃中共有13個菌屬的相對豐度受飼糧NDF水平的顯著影響，其中PrevotellaceaeUCG-001、PrevotellaceaeUCG-003、和RuminococcaceaeUCG-014等菌屬的相對豐度呈現(xiàn)隨NDF水平增加而升高的變化規(guī)律。

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