梁馨文，李強(qiáng)強(qiáng)，高景林，王 凱，吳黎明,*

蜂蜜不僅被作為一種天然的甜味劑，由于其存在的活性成分，也被廣泛應(yīng)用于臨床實踐。已有報道證明蜂蜜具有多種生物活性，例如，抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗癌，降血脂和糖尿病輔助治療等[1-2]。同時，蜂蜜已經(jīng)被作為一種重要的天然抗氧化劑和傷口愈合劑，廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷治療；其對胃腸道的保護(hù)作用可降低腸道炎癥等胃腸道疾病[3]；并能有效抑制埃希氏桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌等致病菌的生長[4-5]，對乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌和骨肉瘤表現(xiàn)出一定的抗癌作用[6-8]；除此之外，蜂蜜已經(jīng)被作為治療糖尿病和高血脂的輔助藥劑，能夠改善甲狀腺功能，并可作為一種肝臟和心臟的保護(hù)劑[9]，有效降低個體患多種疾病的風(fēng)險。

無刺蜂是一類營群體生活并能釀蜜的昆蟲，隸屬于膜翅目（Hymenoptera），蜜蜂總科（Apoidea），蜜蜂科（Apidae），蜜蜂亞科（Apinae），麥蜂族（MeliPonini），無刺蜂屬（Trigona），體呈黑色，體小靈活，是熱帶地區(qū)植物的主要傳粉蜂種，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國僅在云南、海南和臺灣地區(qū)的田間森林有分布。無刺蜂蜂蜜是無刺蜂從植物蜜腺或其他部位采來的花蜜，經(jīng)充分釀造，存儲于巢房的甜蜜物質(zhì)，與西方蜜蜂蜂蜜相比，具有水分含量高、酸度高、酶值低、黏度低等特點(diǎn)[10]。無刺蜂蜂蜜含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分，世界范圍內(nèi)，主要產(chǎn)自秘魯、瓜地馬拉、墨西哥、委內(nèi)瑞拉等國家。Melipona spp.、Scaptotrigona spp.、Trigona spp.等無刺蜂屬蜂蜜已廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)[11]，具有顯著的抗氧化、抗菌、抗突變、促進(jìn)傷口愈合[12-14]等生物活性功能。無刺蜂蜂蜜的化學(xué)成分復(fù)雜，尤其是其主要活性成分酚酸黃酮類物質(zhì)，因蜂種、采集植物、地理環(huán)境、氣候、季節(jié)的變化而導(dǎo)致無刺蜂蜂蜜成分、活性的差異。目前，我國無刺蜂蜂蜜的研究尚處于起步階段，并無有關(guān)我國無刺蜂蜂蜜成分和活性的研究報道。本實驗通過XAD-2柱層析法富集了我國海南無刺蜂蜂蜜中的多酚類有效活性成分，利用液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜法測定其多酚化學(xué)成分，研究我國無刺蜂蜂蜜多酚類提取物的體外抗氧化活性（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽自由基（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) radical，ABTS＋·）的清除、總還原力）及對細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞體外炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，探討無刺蜂蜂蜜的抗炎、抗氧化作用及其可能的機(jī)制，為我國無刺蜂蜂蜜的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃紋無刺蜂（Trigona ventralis Swith）蜂蜜，2016年11月采自海南省白沙黎族自治縣南開鄉(xiāng)；小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW 264.7）由浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院胡福良教授惠贈。

脂多糖、DMEM培養(yǎng)基 美國Sigma公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM寶生物工程（大連）有限公司；Amberlite XAD-2樹脂 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乙醇、乙酸乙酯均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

6510液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜 美國安捷倫科技有限公司；SpectraMax?i3酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計美國賽默飛世爾科技有限公司；PCR儀 東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；熒光定量PCR儀 杭州博中科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)測定

水分含量和pH值采用SN/T 0852—2012《進(jìn)出口蜂蜜檢驗規(guī)程》測定；淀粉酶值采用GB/T 18932.16—2003《蜂蜜中淀粉酶值的測定方法 分光光度法》測定；還原糖（果糖和葡萄糖）和蔗糖含量采用GB/T 18932.22—2003《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的測定方法 液相色譜示差折光檢測法》測定；蛋白質(zhì)含量參照考馬斯亮藍(lán)法測定。

1.3.2 無刺蜂蜂蜜多酚類提取物樣品前處理

稱取800 g無刺蜂蜂蜜，加入4 L醋酸水（pH 2.0），攪拌溶解后100 kHz功率超聲30 min，棉花過濾，待用。Amberlite XAD-2大孔樹脂經(jīng)乙醇浸泡24 h后，稱取800 g活化的大孔樹脂，水洗2～3 遍至無味后倒入無刺蜂蜂蜜水溶液中，動態(tài)攪拌吸附1 h。靜置，棄去上清液，并將大孔樹脂填入玻璃柱中，分別用1.6 L pH 2的醋酸水溶液、2.4 L純水淋洗以除去糖等極性物質(zhì)，最后用6.4 L無水乙醇溶液洗脫并收集洗脫液，40 ℃減壓真空濃縮至固形物，復(fù)溶于10 mL純水，并用40 mL乙酸乙酯萃取。收集乙酸乙酯層，氮?dú)獯蹈?，所得無刺蜂蜂蜜多酚類提取物置于－20 ℃冰箱中備用。

1.3.3 液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜分析無刺蜂蜂蜜多酚類提取物

色譜條件：采用Proshell 120 SB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相為純水（A）-甲醇（B）；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫30 ℃；洗脫梯度為0～2 min，15%；2～10 min，15%～30%；10～25 min，30%～90%；25～30 min，90%；30～31 min，15%。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；載氣溫度350 ℃；干燥氣流速11 L/min；霧化氣壓40 psig。

1.3.4 總酚酸及總黃酮含量測定

選用福林-酚法測定無刺蜂蜂蜜多酚類提取物總酚酸含量[15]，并加以改進(jìn)。將100 μL無刺蜂蜂蜜多酚類提取物溶液和100 μL福林-酚試劑振蕩混勻，避光保存5 min后加入300 μL 0.02 g/mL碳酸鈉溶液，放置2 h，在波長765 nm處測吸光度（96 孔板中測定，200 μL/孔）。結(jié)果用綠原酸當(dāng)量（chlorogenic acid equivalent，CAE）表示。

參照Zhang Jianglin等[15]實驗方法，測定無刺蜂蜂蜜多酚類提取物中總黃酮含量。將150 μL無刺蜂蜂蜜多酚類提取物樣品溶液，10 μL硝酸鋁（100 g/L），10 μL醋酸鉀（9.8 g/L）振蕩混勻，加入30 μL的純水避光反應(yīng)1 h后，在波長415 nm處測吸光度（96 孔板中測定，200 μL/孔）。結(jié)果用槲皮素當(dāng)量（quercitrin equivalent，QE）表示。

1.3.5 自由基清除能力和還原力測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率測定

參照Yang Haisha等[16]方法并適當(dāng)調(diào)整，測定無刺蜂蜂蜜多酚類提取物對DPPH自由基清除能力。將100 μL無刺蜂蜂蜜多酚類提取物溶液和100 μL DPPH工作液混合，加入96 孔板中（100 μL/孔）。室溫避光反應(yīng)30 min后，在波長517 nm處測吸光度。無刺蜂蜂蜜多酚類提取物DPPH自由基清除力用IC50值（μg/mL）表示。

1.3.5.2 ABTS＋·清除率測定

參照Yang Haisha等[16]實驗方法并適當(dāng)調(diào)整，測定無刺蜂蜂蜜多酚類提取物對ABTS＋·清除能力。將100 μL ABTS工作溶液和50 μL樣品溶液加入到96 孔板中，室溫避光放置10 min，在波長734 nm處測吸光度。無刺蜂蜂蜜多酚類提取物ABTS＋·清除力用IC50值（μg/mL）表示。

1.3.5.3 還原力測定

參照Guo Xiali等[17]方法并適當(dāng)調(diào)整，測定無刺蜂蜂蜜多酚類提取物鐵還原力。將50 μL樣品溶液、12.5 μL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）、12.5 μL 1%鐵氰化鉀溶液混合，50 ℃孵育20 min，隨后加入12.5 μL 10%的三氯乙酸?；旌暇鶆蚝? 000×g離心10 min。反應(yīng)體系包括1 mL上清液、12.5 μL蒸餾水和25 μL 0.1%的氯化鐵溶液，混合均勻后加入到96 孔板中（200 μL/孔），在波長700 nm處測定吸光度。結(jié)果用μmol Trolox/g表示。

1.3.6 體外抗炎活性

1.3.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞活力測定

小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7孵育在含體積分?jǐn)?shù)10%熱滅活胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，并放置在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。使用CCK-8測定細(xì)胞生長活力，將10×104/mL小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，孵育24 h后，加入適量不同濃度的無刺蜂蜂蜜多酚類提取物，24 h后再加入10 μL CCK-8，37 ℃反應(yīng)2 h，利用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處吸光度。

1.3.6.2 Greiss法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度

將RAW 264.7細(xì)胞接種在24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，孵育24 h后，加入適量不同濃度的無刺蜂蜂蜜多酚類提取物預(yù)處理1 h，后加入1 μg/mL細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。孵育24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心，取100 μL上清液和100 μL GreissA試劑（1%對氨基苯磺酰胺）混合，吸取100 μL混合液加入96 孔板中，再加入50 μL GreissB試劑（0.1% N-（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽），利用酶標(biāo)儀測定波長550 nm處的吸光度。

1.3.6.3 RNA提取和熒光定量PCR

小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7總RNA通過RNA提取試劑盒提取，置于－80 ℃待測。采用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測RNA濃度和純度，使用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以1 μg總RNA作為合成第1鏈cDNA模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于－20 ℃待用。實驗所需引物信息如表1所示，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實時熒光定量PCR采用SYBR?Premix EX TaqTM試劑盒進(jìn)行，每孔反應(yīng)體系20 μL，利用兩步法PCR檢測。GAPDH為管家基因，對靶標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)化，可作為靶標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)參照物，結(jié)果用2－ΔΔCt表示[18]。

表1 qRT-PCR實驗中的引物序列Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 海南無刺蜂蜂蜜理化成分分析

表2 無刺蜂蜂蜜理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical parameters of stingless bee honey

如表2所示，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)是評價蜂蜜質(zhì)量的一個重要標(biāo)準(zhǔn)，所測無刺蜂蜂蜜樣本的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（26.3±0.1）%，與國外報道的無刺蜂蜂蜜含水量相符（20%～30%）[11,19]。由于蜂蜜產(chǎn)品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（GH/T 18796—2012）中規(guī)定：一級品蜂蜜（Apis mellifera）的水分含量不得高于20 g/100 g，故相比西方蜜蜂（Apis mellifera）蜂蜜，無刺蜂蜂蜜具有較高的含水量，花蜜來源、熱帶雨林氣候條件、土壤條件、采集時間和蜂巢中蜂蜜的成熟程度是影響其水分含量高的主要因素[20]。pH值是影響蜂蜜貨架期的重要因素[21]，海南無刺蜂蜂蜜pH值為3.7±0.2，與國外無刺蜂蜂蜜pH值相符（2.9～5.3）[12,22-23]，蜜源植物和貯存過程是影響其pH值的主要原因[24]。淀粉酶值是判斷蜂蜜質(zhì)量品質(zhì)的重要指標(biāo)，海南無刺蜂蜂蜜的淀粉酶值為（19.6±0.2）mL/（g·h），不同地區(qū)的無刺蜂蜂蜜淀粉酶值存在差異，如澳大利亞為0.4～0.9 mL/（g·h），泰國為1.5～3.1 mL/（g·h），巴西為4.4～49.6 mL/（g·h）等[22,25-26]，地理環(huán)境可能會影響無刺蜂蜂蜜的淀粉酶值。海南無刺蜂蜂蜜的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（46.7±6.0）%，低于西方蜜蜂（Apis mellifera）蜂蜜（＞60%）[27]，其中葡萄糖含量最高，為（24.9±2.2）%，其次為果糖（21.0±3.7）%和蔗糖（0.8±0.1）%，較低的含糖量使無刺蜂蜂蜜甜味較淡[23]。蜂蜜中存在的蛋白質(zhì)主要來源于花蜜、花粉和蜜蜂分泌的酶類[28]。不同種類的無刺蜂蜂蜜蛋白質(zhì)含量存在顯著差異，本實驗所測海南無刺蜂蜂蜜蛋白質(zhì)含量為（628.2±9.0）mg/kg，低于Sousa等[23]報道的巴西無刺蜂蜂蜜蛋白質(zhì)含量（2 000～5 000 mg/kg）。

2.2 無刺蜂蜂蜜多酚類提取物酚酸黃酮分析

建立24 種酚酸黃酮類物質(zhì)液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜檢測方法，其中在海南無刺蜂蜂蜜中檢出15 種酚酸黃酮物質(zhì)，如表3所示。在海南無刺蜂蜂蜜中沒食子酸和桑色素含量最高，分別為225.3 μg/100 g和265.3 μg/100 g。其中海南無刺蜂蜂蜜中沒食子酸的含量顯著高于西方蜜蜂蜂蜜（琵琶、棗花、益母草、野桂花、紫云英、椴樹、荔枝和龍眼（2.6～37.9 μg/100 g））[29]，因此，高含量的沒食子酸可作為海南無刺蜂蜂蜜潛在的標(biāo)志物。丁香酸、阿魏酸、咖啡酸苯乙基酯和芹菜素含量較低，高良姜黃素在無刺蜂蜂蜜中首次檢出，異阿魏酸、迷失香酸、松鼠素、柯因、楊梅素、姜黃素、3,4-二甲氧基肉桂酸、槲皮素和蘆丁這9 種物質(zhì)并沒有在無刺蜂蜂蜜中檢出，但Sousa[19]和Silva[30]等分別在巴西無刺蜂蜂蜜中檢測出楊梅素和蘆丁，說明不同區(qū)域的無刺蜂蜂蜜酚酸黃酮種類存在差異，蜜蜂種屬、植物和地理來源都會影響到蜂蜜中多酚物質(zhì)的差異。此外，已報道的無刺蜂蜂蜜中存在的多酚物質(zhì)還包括安息草酸、苯甲酸衍生物、秦皮苷、佛手柑、白楊素、脫落酸、多種二碳-芹菜素苷、異鼠李素苷和黃酮碳苷，這也表明對于我國無刺蜂蜂蜜中多酚物質(zhì)仍需更進(jìn)一步研究[12,19,30]。

表3 液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜分析15 種酚酸黃酮化合物在無刺蜂蜂蜜中含量Table 3 Contents of 15 compounds in SBH

2.3 無刺蜂蜂蜜多酚類提取物抗氧化性

表4 無刺蜂蜂蜜多酚類提取物總酚酸和總黃酮含量及抗氧化能力Table 4 Total flavonoid, total phenolic content and antioxidant activity

蜂蜜的生物活性很大程度上取決于酚酸黃酮含量，因此對于無刺蜂蜂蜜的多酚成分分析是研究其生物活性功能的重要基礎(chǔ)。由表4可知，無刺蜂蜂蜜多酚類提取物的總酚酸和總黃酮含量分別為（96.6±0.4）μg CAE/g和（16.1±0.3）μg QE/g，酚酸黃酮類物質(zhì)含量豐富。其總黃酮含量高于Apis mellifera蜂蜜（如柑橘蜂蜜：1.7 μg QE/g；椴樹蜂蜜：9.5 μg QE/g）[31-32]。已有研究結(jié)果表明，植物的生長環(huán)境和氣候條件會直接影響花蜜的成分組成[33]，接受充足陽光的植物比生長在陰涼處相同品種及其他植物具有更多的多酚含量[34]，特別是陽光充足、炎熱潮濕的地區(qū)（如海南熱帶雨林地區(qū)）對于植物中的多酚含量影響顯著，使得無刺蜂蜂蜜中含有較多的多酚物質(zhì)。

基于DPPH、ABTS和還原力具有顯著的重復(fù)性和可靠性，廣泛用于定量測定天然產(chǎn)物和植物提取物的抗氧化能力[35]。DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，通過捕獲物質(zhì)的自由基反映其抗氧化性；ABTS氧化后生成藍(lán)綠色ABTS＋·，當(dāng)抗氧化物存在時ABTS＋·受到抑制；還原Fe3＋離子能力能夠反映物質(zhì)的抗氧化能力。由表4可知，無刺蜂蜂蜜多酚類提取物DPPH自由基清除能力IC50值為（435.1±0.4） μg/mL，ABTS＋·清除能力IC50值為（423.0±0.3）μg/mL，還原力為（0.6±0.02） μmol Trolox/g，具有很好的抗氧化性。蜂蜜的抗氧化性主要取決于一些生物活性化合物，尤其是黃酮物質(zhì)和酚酸物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠直接捕獲活性氧，抑制相關(guān)酶類降低超氧化物陰離子的釋放，螯合過度金屬，阻止過氧化過程[36]。此外，Silva等[37]研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜中的酚醛類物質(zhì)（安息香酸、沒食子酸和香草酸）具有較強(qiáng)的自由基清除能力和鐵離子還原能力。由此推測，無刺蜂蜂蜜較好的抗氧化性來源于其豐富的黃酮類物質(zhì)及高含量的沒食子酸。

2.4 無刺蜂蜂蜜多酚類提取物對RAW 264.7細(xì)胞活力的影響

圖1 多酚類提取物對RAW 264.7細(xì)胞活力的影響Fig. 1 Effects of SBH on the viability of RAW 264.7 cells

為保證無刺蜂蜂蜜對細(xì)胞的新陳代謝沒有毒性作用，使用CCK-8測定不同質(zhì)量濃度無刺蜂蜂蜜多酚類提取物對RAW 264.7細(xì)胞生長活力的影響，確定無刺蜂蜂蜜多酚類提取物使用的最適質(zhì)量濃度，如圖1所示。質(zhì)量濃度為5～50 μg/mL時，對RAW 264.7細(xì)胞生長活力未出現(xiàn)抑制作用，尤其是無刺蜂蜂蜜多酚類提取物的質(zhì)量濃度為50 μg/mL時可以極顯著的促進(jìn)細(xì)胞的生長活力。質(zhì)量濃度為100 μg/mL時細(xì)胞活力受到高度顯著性抑制，質(zhì)量濃度在200～400 μg/mL時對細(xì)胞的生長活力有極顯著的抑制作用，因此以100 μg/mL設(shè)為實驗上限質(zhì)量濃度。

2.5 無刺蜂蜂蜜多酚類提取物對RAW 264.7細(xì)胞體外抗炎作用

巨噬細(xì)胞在天然免疫中具有關(guān)鍵作用，激活的巨噬細(xì)胞能夠啟動和增加多種炎癥反應(yīng)[38]。抑制巨噬細(xì)胞的激活或阻礙巨噬細(xì)胞NO的過度釋放可作為抑制多種炎癥反應(yīng)的治療方法[39]。RAW 264.7細(xì)胞是由Abelson小鼠白血病病毒轉(zhuǎn)換的巨噬細(xì)胞，對多種炎癥刺激具有免疫活性[40]。本研究選用1 μg/mL LPS刺激細(xì)胞建立體外抗炎模型。為探討無刺蜂蜂蜜多酚類提取物對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，利用Greiss反應(yīng)測定細(xì)胞NO釋放量及熒光定量PCR檢測一些炎癥因子。

2.5.1 無刺蜂蜂蜜多酚類提取物對NO釋放作用

圖2 多酚類提取物對RAW 264.7細(xì)胞釋放NO能力的影響Fig. 2 Effect of SBH on nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 cells

炎癥發(fā)生時，巨噬細(xì)胞可分泌大量NO，NO作為一種重要的跨膜分子信號，能夠損傷周圍組織[41]。已有報道表明LPS作用RAW 264.7細(xì)胞可以急劇增加NO的釋放量，造成細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[42]。本研究評價了不同質(zhì)量濃度的無刺蜂蜂蜜多酚類提取物對1 μg/mL LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞NO釋放量的影響，結(jié)果見圖2。經(jīng)LPS刺激24 h后，刺激前用不同質(zhì)量濃度無刺蜂蜂蜜多酚類提取物處理1 h，其NO的釋放量顯著低于未經(jīng)蜂蜜樣品前處理組，表明無刺蜂蜂蜜多酚類提取物對NO的釋放有一定的抑制作用。且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，NO釋放量逐步降低，說明NO的釋放量與樣品的質(zhì)量濃度呈一定的相關(guān)性。在濃度為50、100 μg/mL和200 μg/mL時，對NO的釋放量有極顯著的抑制作用。由此推測無刺蜂蜂蜜多酚類提取物通過抑制NO的釋放起到抗炎作用。

2.5.2 無刺蜂蜂蜜多酚類提取物對炎癥調(diào)節(jié)因子mRNA的水平表達(dá)

為了評估無刺蜂蜂蜜多酚類提取物對LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞mRNA表達(dá)水平的影響，本研究利用qRT-PCR測定了參與炎癥反應(yīng)的5 個關(guān)鍵基因表達(dá)量。iNOS在炎癥過程高量表達(dá)，可造成NO在細(xì)胞培養(yǎng)基的積累[43]；IL-1β是一種重要的促炎癥因子，能夠加劇炎癥反應(yīng)，造成組織器官損傷[44]；IL-6促炎細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)過程中能夠出現(xiàn)高量表達(dá)[42]；HO-1是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白質(zhì)，能夠有效調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，具有抗氧化作用，在炎癥反應(yīng)過程中高量表達(dá)能夠降低NO的釋放而抑制炎癥反應(yīng)，并增強(qiáng)細(xì)胞抵抗凋亡的能力[45]；MCP-1是重要的細(xì)胞趨化因子，能夠趨化及活化血液中的單核/巨噬細(xì)胞向炎癥部位聚集，在炎癥細(xì)胞滲透中發(fā)揮重要作用，參與多種慢性炎癥疾病，并在激活的巨噬細(xì)胞中高水平表達(dá)[46]。因此，這些細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平可作為抗炎活性的重要指標(biāo)。

圖3 多酚類提取物對RAW 264.7細(xì)胞相關(guān)炎癥基因mRNA水平表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of SBH on mRNA expression levels of key inflammatory genes in LPS-stimulated RAW 264.7 cells

如圖3所示，相比LPS未刺激對照組，LPS刺激組對于炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄有明顯變化，能夠誘導(dǎo)iNOS、IL-1β、IL-6和MCP-1基因的高表達(dá)。與LPS組比較，低質(zhì)量濃度無刺蜂蜂蜜多酚類提取物預(yù)處理組（50 μg/mL）能夠極顯著抑制iNOS和IL-1β基因mRNA的水平表達(dá)（P＜0.001），基因表達(dá)水平隨無刺蜂蜂蜜多酚類提取物質(zhì)量濃度的增加而降低，具有一定的質(zhì)量濃度相關(guān)性。并極顯著增強(qiáng)HO-1基因mRNA的水平表達(dá)（P＜0.001），其表達(dá)水平隨著劑量的增大而加強(qiáng)，由此推測無刺蜂蜂蜜多酚類提取物作為一種強(qiáng)氧化劑保護(hù)損傷細(xì)胞。無刺蜂蜂蜜多酚類提取物預(yù)處理組對IL-6基因mRNA的水平表達(dá)抑制性不顯著，50 μg/mL處理組并沒有出現(xiàn)抑制作用，但質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，高度顯著抑制基因的表達(dá)（P＜0.01），其對IL-6基因的抑制作用低于iNOS和IL-1β基因。50 μg/mL無刺蜂蜂蜜多酚類提取物預(yù)處理組高度顯著抑制MCP-1基因mRNA的水平表達(dá)（P＜0.01），質(zhì)量濃度為100 μg/mL時具有極顯著的抑制作用。這些結(jié)果表明，無刺蜂蜂蜜多酚類提取物具有較強(qiáng)的抗炎作用，其抗炎活性在炎癥過程中能夠選擇性的改變抗炎相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。

3 結(jié) 論

無刺蜂蜂蜜理化指標(biāo)如下：水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（26.3±0.1）%，pH 3.7±0.2，蛋白質(zhì)含量為（628.2±9.0）mg/kg，淀粉酶值為（19.6±0.2） mL/（g·h），總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（46.7±6.0）%，包括果糖（21.0±3.7）%、葡萄糖（24.9±2.2）%、蔗糖（0.8±0.1）%，相比西方蜜蜂蜂蜜，無刺蜂蜂蜜具有水分高、口感酸、糖度低等特點(diǎn)。無刺蜂蜂蜜多酚類提取物富含酚酸和黃酮物質(zhì)，其總酚酸和總黃酮含量分別為（96.6±0.4）μg CAE/g和（16.1±0.3）μg QE/g。無刺蜂蜂蜜多酚類提取物DPPH自由基和ABTS＋·清除能力IC50值分別為（435.1±0.4）μg/mL和（423.0±0.3）μg/mL，還原力為（0.6±0.02）μmol Trolox/g，具有較強(qiáng)的抗氧化能力。細(xì)胞實驗表明，無刺蜂蜂蜜多酚類提取物能夠有效抑制NO的產(chǎn)生，抑制iNOS、IL-1β、IL-6和MCP-1相關(guān)促炎基因的表達(dá)，同時增強(qiáng)HO-1的基因表達(dá)，具有較強(qiáng)的抗炎活性。無刺蜂蜂蜜多酚類提取物的抗氧化和抗炎活性為我國無刺蜂蜂蜜的開發(fā)利用提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] KISHORE R K, HALIM A S, SYAZANA M S, et al. Tualang honey has higher phenolic content and greater radical scavenging activity compared with other honey sources[J]. Nutrition Research, 2011,31(4): 322-325. DOI:10.1016/j.nutres.2011.03.001.

[2] VIUDA-MARTOS M, RUIZ-NAVAJAS Y, FERNáNDEZ-LóPEZ J, et al. Functional properties of honey, propolis, and royal jelly[J].Journal of Food Science, 2008, 73(9): 117-124. DOI:10.1111/j.1750-3841.2008.00966.x.

[3] EL-ARAB A M E, GIRGIS S M, HEGAZY E M, et al. Effect of dietary honey on intestinal microflora and toxicity of mycotoxins in mice[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2006, 6(1):1-13. DOI:10.1186/1472-6882-6-6.

[4] GULFRAZ M, IFTIKHAR F, RAJA S, et al. Quality assessment and antimicrobial activity of various honey types of Pakistan[J]. African Journal of Biotechnology, 2016, 9(41): 6902-6906. DOI:10.5897/AJB10.003.

[5] MCGOVERN D P, ABBAS S Z, VIVIAN G, et al. Manuka honey against Helicobacter pylori[J]. Journal of the Royal Society of Medicine, 1999, 92(8): 439. DOI:10.1177/014107689909200832.

[6] FAUZI A N, NORAZMI M N, YAACOB N S. Tualang honey induces apoptosis and disrupts the mitochondrial membrane potential of human breast and cervical cancer cell lines[J]. Food & Chemical Toxicology,2011, 49(4): 871-878. DOI:10.1016/j.fct.2010.12.010.

[7] SAEED S, TAVAKKOL A J, SAEIDEH D. Chrysin reduces proliferation and induces apoptosis in the human prostate cancer cell line pc-3[J]. Clinics, 2011, 66(6): 1073-1079. DOI:10.1590/S1807-59322011000600026.

[8] GHASHM A A, ISMAIL N M, OTHMAN N H, et al. Antiproliferative effect of Tualang honey on oral squamous cell carcinoma and osteosarcoma cancer cell lines[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2010, 10(1): 49-57. DOI:10.1186/1472-6882-10-49.

[9] RAHMAN S, BEGUM M M, MAHADI H, et al. Comparative study of anti-hyperglycemic and anti hyperlipidemic effects of honey, coccinia cordifoliaand hilsha fish oil in streptozotocin induced diabetic rats[J].Pharmaceutical Biology, 2016, 51(2): 253-259. DOI:10.4172/0974-8369.1000272.

[10] ALMEIDA-MURADIAN L B D, STRAMM K M, ESTEVINHO L M. Efficiency of the FT-IR ATR spectrometry for the prediction of the physicochemical characteristics of Melipona subnitida, honey and study of the temperature’s effect on those properties[J]. International Journal of Food Science & Technology, 2013, 49(1): 188-195.DOI:10.1111/ijfs.12297.

[11] SOUZA B A, ROUBIK B, BARTH D, et al. Composition of stingless bee honey: setting quality standards[J]. Interciencia, 2006, 31(12):867-875. DOI:10.1007/s00464-010-1064-4.

[12] GUERRINI A, BRUNI R, MAIETTI S, et al. Ecuadorian stingless bee (Meliponinae) honey: a chemical and functional profile of an ancient health product[J]. Food Chemistry, 2009, 114(4): 1413-1420.DOI:10.1016/j.foodchem.2008.11.023.

[13] IRISH J, CARTER D A, BLAIR S E, et al. Antibacterial activity of honey from the Australian stingless bee Trigona carbonaria[J].International Journal of Antimicrobial Agents, 2008, 32(1): 89-90.DOI:10.1016/j.ijantimicag.2008.02.012.

[14] BOORN K L, KHOR Y Y, SWEETMAN E, et al. Antimicrobial activity of honey from the stingless bee Trigona carbonaria determined by agar diffusion, agar dilution, broth microdilution and time-kill methodology[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010,108(5): 1534-1543. DOI:10.1111/j.1365-2672.2009.04552.x.

[15] ZHANG J L, SHEN X, WANG K, et al. Antioxidant activities and molecular mechanisms of the ethanol extracts of Baccharis propolis and Eucalyptus propolis in RAW64.7 cells[J]. Pharmaceutical Biology,2016, 54(10): 1-16. DOI:10.3109/13880209.2016.1151444.

[16] YANG H S, DONG Y, DU H, et al. Antioxidant compounds from propolis collected in Anhui, China[J]. Molecules, 2011, 16(4): 3444-3455. DOI:10.3390/molecules16043444.

[17] GUO X L, CHEN B, LUO L, et al. Chemical compositions and antioxidant activities of water extracts of chinese propolis[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2011, 59(23): 12610-12616.DOI:10.1021/jf202818p.

[18] XIE C, KANG J, LI Z, et al. The a?aí flavonoid velutin is a potent anti-inflammatory agent: blockade of LPS-mediated TNF-α and IL-6 production through inhibiting NF-κB activation and MAPK pathway[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2012, 23(9): 1184-1191. DOI:10.1016/j.jnutbio.2011.06.013.

[19] SOUSA J M D, SOUZA E D, MARQUES G, et al. Polyphenolic profile and antioxidant and antibacterial activities of monofloral honeys produced by Meliponini in the Brazilian semiarid region[J].Food Research International, 2016, 84: 61-68. DOI:10.1016/j.foodres.2016.03.012.

[20] SILVANO M F, VARELA M S, PALACIO M A, et al.Physicochemical parameters and sensory properties of honeys from Buenos Aires region[J]. Food Chemistry, 2014, 152(2): 500-507.DOI:10.1016/j.foodchem.2013.12.011.

[21] FINOLA M S, LASAGNO M C, MARIOLI J M. Microbiological and chemical characterization of honeys from central Argentina[J].Food Chemistry, 2007, 100(4): 1649-1653. DOI:10.1016/j.foodchem.2005.12.046.

[22] CHUTTONG B, CHANBANG Y, SRINGARM K, et al.Physicochemical profiles of stingless bee (Apidae: Meliponini) honey from South East Asia (Thailand)[J]. Food Chemistry, 2016, 192: 149-155. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.06.089.

[23] SOUSA J M B D, SOUZA E L D, MARQUES G, et al. Sugar profile,physicochemical and sensory aspects of monofloral honeys produced by different stingless bee species in Brazilian semi-arid region[J].LWT-Food Science and Technology, 2016, 65: 645-651. DOI:10.1016/j.lwt.2015.08.058.

[24] VANHANEN L P, EMMERTZ A, SAVAGE G P. Mineral analysis of mono-floral New Zealand honey[J]. Food Chemistry, 2011, 128(1):236-240. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.02.064.

[25] BILUCA F C, BRAGHINI F, GONZAGA L V, et al. Physicochemical profiles, minerals and bioactive compounds of stingless bee honey(Meliponinae)[J]. Journal of Food Composition & Analysis, 2016, 50:61-69. DOI:10.1016/j.jfca.2016.05.007.

[26] ODDO L P, HEARD T A, RODRíGUEZ-MALAVER A, et al.Composition and antioxidant activity of Trigona carbonaria honey from Australia[J]. Journal of Medicinal Food, 2008, 11(4): 789-794.DOI:10.1089/jmf.2007.0724.

[27] BOGDANOV S, LüLLMANN C, MARTIN P, et al. Honey quality and international regulatory standards: review by the International Honey Commission[J]. Mitteilungen Aus Lebensmitteluntersuchung Und Hygiene, 1999, 90(1): 108-125. DOI:10.1080/000577 2X.1999.11099428.

[28] 周厚報. 單花種蜂蜜中蛋白質(zhì)及氨基酸組分研究[D]. 西安: 西北大學(xué), 2015.

[29] 孫崇臻, 王超, 蔡子哲, 等. 高效液相色譜測定蜂蜜中的脫落酸、黃酮和酚酸[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(10): 281-285. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201310062.

[30] SILVA I A A D, SILVA T M S D, CAMARA C A, et al. Phenolic profile, antioxidant activity and palynological analysis of stingless bee honey from Amazonas, Northern Brazil[J]. Food Chemistry, 2013,141(4): 3552-3558. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.06.072.

[31] LIANDA, SANT’ANA R L P, D’OLIVEIRAECHEVARRIA L, et al.Antioxidant activity and phenolic composition of brazilian honeys and their extracts[J]. Journal of the Brazilian Chemical Society, 2012,91(5): 689-698. DOI:10.1590/S0103-50532012000400006.

[32] CAN Z, YILDIZ O, SAHIN H, et al. An investigation of Turkish honeys: their physico-chemical properties, antioxidant capacities and phenolic profiles[J]. Food Chemistry, 2015, 180: 133-141.DOI:10.1016/j.foodchem.2015.02.024.

[33] SHANTAL R F M, ESCUREDO O, CARMEN S M. Assessment of physicochemical and antioxidant characteristics of Quercus pyrenaica honeydew honeys[J]. Food Chemistry, 2015, 166: 101-106.DOI:10.1016/j.foodchem.2014.06.005.

[34] TENORE G C, RITIENI A, CAMPIGLIA P, et al. Nutraceutical potential of monofloral honeys produced by the Sicilian black honeybees (Apis mellifera, ssp. sicula)[J]. Food & Chemical Toxicology, 2012, 50(6): 1955-1961. DOI:10.1016/j.fct.2012.03.067.

[35] DUDONNé S, VITRAC X, COUTIèRE P, et al. Comparative study of antioxidant properties and total phenolic content of 30 plant extracts of industrial interest using DPPH, ABTS, FRAP, SOD, and ORAC assays[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2009, 57(5):1768-1774. DOI:10.1021/jf803011r.

[36] BRIDI R, MONTENEGRO G. Honey analysis[M]. Croatia: InTECH,2017: 63-78. DOI:10.5772/67103.

[37] SILVA T M S, SANTOS F P D, EVANGELISTA-RODRIGUES A,et al. Phenolic compounds, melissopalynological, physicochemical analysis and antioxidant activity of jandaíra (Melipona subnitida)honey[J]. Journal of Food Composition & Analysis, 2013, 29(1): 10-18. DOI:10.1016/j.jfca.2012.08.010.

[38] CHAWLA A, NGUYEN K D, GOH Y P. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease[J]. Nature Reviews Immunology,2011, 11(11): 738-749. DOI:10.1038/nri3071.

[39] DUFFIELD J S. The inflammatory macrophage: a story of Jekyll and Hyde[J]. Clinical Science, 2003, 104(1): 27-38. DOI:10.1042/cs1040027.

[40] NDIAYE F, VUONG T, DUARTE J, et al. Anti-oxidant, antiinflammatory and immunomodulating properties of an enzymatic protein hydrolysate from yellow field pea seeds[J]. European Journal of Nutrition, 2012, 51(1): 29-37. DOI:10.1007/s00394-011-0186-3.

[41] NATHAN C, XIE Q W. Nitric oxide synthases: roles, tolls and controls[J]. Cell, 1994, 78(6): 915-918. DOI:1016/0092-8674(94)90266-6.

[42] SZLISZKA E, MERTAS A, CZUBA Z P, et al. Inhibition of inflammatory response by Artepillin C in activated RAW264.7 Macrophages[J]. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 2013: 735176. DOI:10.1155/2013/735176.

[43] ROSSI A, LIGRESTI A, LONGO R, et al. The inhibitory effect of propolis and caffeic acid phenethyl ester on cyclooxygenase activity in J774 macrophages[J]. Phytomedicine, 2002, 9(6): 530-535.DOI:10.1078/09447110260573164.

[44] KYUNGHEE L, EUNMI C. Effect of pine pollen extract on experimental chronic arthritis[J]. Phytotherapy Research Ptr, 2009,23(5): 651-657. DOI:10.1002/ptr.2526.

[45] LIU Z M, CHEN G G, NG E K, et al. Upregulation of heme oxygenase-1 and p21 confers resistance to apoptosis in human gastric cancer cells[J]. Oncogene, 2004, 23(2): 503-513. DOI:10.1038/sj.onc.1207173 .

[46] REMPPIS A, BEA F, GRETEN H J, et al. Rhizoma coptidis inhibits LPS-induced MCP-1/CCL2 production in murine macrophages via an AP-1 and NF-kappaB-dependent pathway[J]. Mediators of Inflammation, 2010, 2010(1): 194896. DOI:10.1155/2010/194896.