李微，張娜，張聰，劉月平，任曙光

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011)

放療及化療是卵巢癌患者的主要治療手段，但其對(duì)卵巢組織可造成嚴(yán)重的不可逆損傷，常導(dǎo)致卵巢早衰[1]。凍存卵巢組織為年輕女性腫瘤及血液病患者保存生育力的一種方式[2～4]，但卵巢組織經(jīng)過冷凍后血管會(huì)出現(xiàn)一定程度的損傷，但血管損傷的機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，血管生成素2(Ang-2)及其受體酪氨酸激酶受體2(Tie-2)在發(fā)育的卵泡中均有表達(dá)，二者與卵泡的發(fā)育、閉鎖相關(guān)，對(duì)各級(jí)卵泡的發(fā)育均會(huì)產(chǎn)生影響[5,6]。2016年5月～2017年4月，我們分別應(yīng)用慢速冷凍法及玻璃化冷凍法對(duì)小鼠卵巢組織進(jìn)行冷凍，比較解凍后兩組卵泡正常率及卵巢組織Ang-2、Tie-2表達(dá)，現(xiàn)分析結(jié)果，以期尋找更適合凍存卵巢組織的方法。

1　材料與方法

1.1材料SPF級(jí)8周齡健康BALB/C雌鼠60只，體質(zhì)量17～20 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003。鼠抗人Ang-2多克隆抗體購(gòu)自上海Abcam貿(mào)易有限公司，鼠抗人Tie-2單克隆抗體和免疫組織化學(xué)試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2動(dòng)物分組及處理將小鼠隨機(jī)均分為慢速冷凍組、玻璃化冷凍組各30只。兩組均給予2%戊巴比妥鈉(2 mL/kg)腹腔注射麻醉，手術(shù)切除雙側(cè)完整卵巢，去除周圍結(jié)締組織，將卵巢組織切成2 mm×2 mm×2 mm的小塊。慢速冷凍組冷凍及解凍方法：冷凍過程參考Mikkel等[7]的方法，冷凍液和解凍液均采用含10%白蛋白的PBS為基礎(chǔ)液。放入預(yù)先加入1 mL冷凍保護(hù)液(含1.5 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖)的1.8 mL冷凍瓶中，4 ℃平衡25 min；放入慢速冷凍儀中，從4 ℃開始以2 ℃/min降至-9 ℃；植冰，保持10 min，以0.3 ℃/min降至-40 ℃，再以10 ℃/min降至-140 ℃，然后直接投入液氮中。冷凍21天結(jié)束時(shí)，從液氮中迅速將卵巢組織取出放入37 ℃水浴鍋中直至呈液體狀(60～90 s)，再分別放入解凍液(含0.75 mol/L乙二醇、0.25 mol/L蔗糖)中10 min、稀釋液(0.5 mol/L蔗糖)中10 min、基礎(chǔ)液中10 min。玻璃化冷凍組冷凍及解凍方法：冷凍過程參考汪翔等[8]的方法，冷凍液和解凍液均采用含10%白蛋白的PBS基礎(chǔ)液。在室溫條件下將卵巢放入冷凍液(含7.5%乙二醇、7.5%二甲基亞砜)中25 min，然后放入玻璃化液(含15%乙二醇、15%二甲基亞砜、0.5 mol/L蔗糖)中15 min(包括裝入載桿)，然后直接投入液氮中。每根冷凍載桿放2塊卵巢組織。冷凍21天結(jié)束時(shí)，從液氮中迅速將載桿取出放入37 ℃解凍液(含1 mol/L蔗糖)中3 min，然后放入稀釋液(含0.5 mol/L蔗糖)中5 min、基礎(chǔ)液中5 min。

1.3卵巢組織病理學(xué)觀察將卵巢組織放入4%甲醛中固定24 h，常規(guī)切片后行HE染色，于光鏡(400倍)下觀察卵巢組織，根據(jù)Gougeon[9]標(biāo)準(zhǔn)判定各級(jí)卵泡：始基卵泡：?jiǎn)螌颖馄交虮馄脚c立方混合的前顆粒細(xì)胞包繞初級(jí)卵母細(xì)胞；初級(jí)卵泡：?jiǎn)螌恿⒎叫皖w粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞；次級(jí)卵泡：≥2層的立方型顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞。正常卵泡呈圓形，顆粒細(xì)胞分布均勻，基底膜完整。異常卵泡可表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)不完整或消失，顆粒細(xì)胞排列不規(guī)則、部分脫落，部分可見卵母細(xì)胞核固縮或皺縮[10]。比較兩組各級(jí)卵泡正常率。

1.4卵巢組織Ang-2和Tie-2表達(dá)檢測(cè)采用免疫組化法。Ang-2工作濃度為1∶250，Tie-2為1∶100。Tie-2與Tie-2陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本為脾臟正常組織，陰性對(duì)照用PBS緩沖液代替一抗。Ang-2陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕褐色顆粒，Tie-2陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒，染色均高于背景。Ang-2和Tie-2計(jì)數(shù)采用半定量分析方法，400倍高倍視野下隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占全部細(xì)胞的比例。判定標(biāo)準(zhǔn)[11]：-為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%；+為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～30%；++為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<30%～66%；+++為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>66%。+、++、+++均記為陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組各級(jí)卵泡情況比較慢速冷凍組始基卵泡正常率高于玻璃化冷凍組(P<0.05)，初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡正常率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1　兩組卵巢組織中各級(jí)卵泡情況[個(gè)(%)]

2.2兩組卵巢組織Ang-2、Tie-2表達(dá)比較兩組卵泡膜細(xì)胞Ang-2、Tie-2陽(yáng)性表達(dá)率均<30%，因此只有-和+兩種表達(dá)情況。兩組顆粒細(xì)胞冷凍前Ang-2(+++)、Tie-2(+++)陽(yáng)性表達(dá)率均高于冷凍后，慢速冷凍組解凍后顆粒細(xì)胞Ang-2(+++)、Tie-2(+++)陽(yáng)性表達(dá)率均高于玻璃化冷凍組；兩組卵泡膜細(xì)胞冷凍前Ang-2、Tie-2陽(yáng)性表達(dá)率均高于冷凍后，慢速冷凍組解凍后卵泡膜細(xì)胞Ang-2、Tie-2陽(yáng)性表達(dá)率均高于玻璃化冷凍組；組間及組內(nèi)比較P均<0.05。見表2～4。

表2　　　　兩組卵巢組織冷凍前后顆粒細(xì)胞Ang-2、Tie-2表達(dá)情況(例)

注：與同組冷凍前比較，*P<0.05；與玻璃化冷凍組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

表3　　　　兩組卵巢組織冷凍前后卵泡膜細(xì)胞Ang-2、Tie-2表達(dá)情況(例)

注：與同組冷凍前比較，*P<0.05；與玻璃化冷凍組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

表4　兩組卵巢組織顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞中Ang-2、Tie-2表達(dá)陽(yáng)性率比較(%)

注：與同組冷凍前比較，*P<0.05；與玻璃化冷凍組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

3　討論

卵泡的發(fā)育過程為始基卵泡-初級(jí)卵泡-次級(jí)卵泡-竇前卵泡-竇腔卵泡，而始基卵泡是雌性動(dòng)物的基本生殖單位，是整個(gè)生殖期中各級(jí)卵泡及卵子發(fā)育的源頭，也是雌性動(dòng)物生殖功能的儲(chǔ)存池。因此，卵巢冷凍過程中始基卵泡保護(hù)得當(dāng)是冷凍成功的關(guān)鍵。慢速程序化冷凍法和玻璃化冷凍法均為目前常用的卵巢組織冷凍方法。慢速程序化冷凍采用低濃度的冷凍保護(hù)劑，從而降低細(xì)胞毒性；但冷凍過程易產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶，容易造成細(xì)胞損傷，且步驟繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，所需設(shè)備昂貴。玻璃化冷凍是一種快速的方法，使細(xì)胞內(nèi)外液態(tài)直接轉(zhuǎn)化為非晶體的玻璃化態(tài)，此過程可減少細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，且不需要使用特殊的設(shè)備，節(jié)省時(shí)間和成本；缺點(diǎn)是需使用高濃度的冷凍保護(hù)劑，對(duì)細(xì)胞毒性較大。玻璃化冷凍法在冷凍卵母細(xì)胞、胚胎方面取得了一定的進(jìn)展。但目前尚無(wú)統(tǒng)一的玻璃化冷凍保存體系，因此該方法對(duì)冷凍卵巢組織的效果并不穩(wěn)定，哪一種方法更適于凍存卵巢組織目前也尚無(wú)定論。

Ang-2主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中與內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體Tie-2結(jié)合，使內(nèi)皮細(xì)胞之間及內(nèi)皮細(xì)胞與支持細(xì)胞之間出現(xiàn)解離，降低血管穩(wěn)定性，使血管彈性增大，促進(jìn)血管重構(gòu)[12,13]。Tie-2磷酸化參與血管生成的延續(xù)過程，使血管成熟穩(wěn)定[14]。有學(xué)者通過對(duì)成年動(dòng)物生殖系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，Ang-2僅表達(dá)在血管形成活躍的組織中，如卵巢、子宮、胎盤等[15]。Nishigaki等[16]亦發(fā)現(xiàn)，Ang-2與Tie-2在卵巢組織中表達(dá)，與血管生成相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，慢速程序化冷凍法和玻璃化冷凍法均會(huì)對(duì)卵巢組織產(chǎn)生一定的損傷。損傷表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是Ang-2和Tie-2表達(dá)變化，二是各級(jí)卵泡形態(tài)學(xué)改變。本實(shí)驗(yàn)中竇前卵泡及竇腔卵泡數(shù)量太少，因此未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。解凍后兩組顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞中Ang-2和Tie-2表達(dá)均弱于冷凍前，且慢速冷凍法對(duì)Ang-2及其受體的損傷程度要小于玻璃化冷凍法。但Choi等[17]采用兩種方法冷凍裸鼠卵巢組織，發(fā)現(xiàn)其對(duì)卵巢組織Ang-2表達(dá)的影響無(wú)明顯差異。結(jié)果產(chǎn)生差異的原因可能與研究對(duì)象、實(shí)驗(yàn)條件等不同有關(guān)。本研究?jī)山M顆粒細(xì)胞Ang-2和Tie-2表達(dá)陽(yáng)性率均高于卵泡膜細(xì)胞，說明Ang-2和Tie-2與卵泡的發(fā)育密切相關(guān)。Fabbri等[18]認(rèn)為，由于始基卵泡體積較小、缺乏卵泡液、無(wú)透明帶，冷凍保護(hù)劑更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，冷凍對(duì)其損傷較小。由于初級(jí)卵泡及次級(jí)卵泡體積增大、細(xì)胞液增多，因此冷凍對(duì)其損傷較大。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，兩組解凍后始基卵泡正常率最高，均高于50%，而初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的正常率均不足40%，說明始基卵泡更易耐受冷凍；慢速冷凍的始基卵泡正常率明顯高于玻璃化冷凍，說明慢速冷凍方法在保護(hù)卵泡方面要優(yōu)于玻璃化冷凍法，與Oktay等[19]研究結(jié)果相同。Ting等[20]研究發(fā)現(xiàn)，慢速冷凍組初級(jí)卵泡的正常率與玻璃化冷凍組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符；玻璃化冷凍組次級(jí)卵泡正常率高于慢速冷凍組，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，可能是由于不同實(shí)驗(yàn)室有不同的冷凍操作有關(guān)。

本研究中無(wú)論是在Ang-2、Tie-2，還是在卵泡結(jié)構(gòu)損傷方面，慢速冷凍的損傷均小于玻璃化冷凍。分析原因有以下幾點(diǎn)：①慢速冷凍為程序化冷凍，大部分步驟在冷凍儀內(nèi)進(jìn)行，時(shí)間固定，客觀性強(qiáng)，誤差較??；玻璃化冷凍人為因素較多，每一次的操作不能保證完全相同。②慢速冷凍的低濃度保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞損傷較小，玻璃化冷凍高濃度的保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大毒性和滲透性損傷。③玻璃化冷凍速度較快，有可能造成冷凍保護(hù)劑滲透不充分，未能起到完全的保護(hù)作用。

綜上所述，慢速冷凍法、玻璃化冷凍法保存卵巢組織均會(huì)損傷卵巢組織內(nèi)各級(jí)卵泡，并導(dǎo)致Ang-2、Tie-2表達(dá)變化；但慢速冷凍法對(duì)卵巢組織的損傷相對(duì)較小。

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