熊 睿，汪曉泊，殷生芝，海應(yīng)措，張曉雯，朱 楠，王小明

0 引言

機(jī)體創(chuàng)傷后可表現(xiàn)為高代謝的負(fù)氮平衡及全身炎癥反應(yīng)狀態(tài)，使機(jī)體遭受嚴(yán)重的損傷[1-2]。過(guò)度的炎性反應(yīng)過(guò)后可出現(xiàn)過(guò)度抗炎反應(yīng)，最終使機(jī)體出現(xiàn)免疫力低下，并導(dǎo)致全身感染等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生[3]。積極的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)可改善創(chuàng)傷患者的預(yù)后[4]。本研究通過(guò)構(gòu)建創(chuàng)傷大鼠模型，于發(fā)病后不同時(shí)間點(diǎn)給予腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)支持，并觀察其對(duì)創(chuàng)傷大鼠TNF-α、β-EP、IL-10的表達(dá)及免疫功能的影響，為早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)治療提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠40只，雄性，體重250～400 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，在清潔級(jí)環(huán)境下普食飼養(yǎng)，12 h交替光照。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器 ELISA試劑盒(江萊生物科技有限公司)，CD3+、CD4+、CD8+硫氰基熒光素標(biāo)記的單克隆抗體(美國(guó)Becton-Dickinson公司)，流式細(xì)胞儀器(德國(guó)Beckman Dickinson公司)，士強(qiáng)(荷蘭Nutricia公司)，EN輸注泵(荷蘭Nutricia公司)。

1.3 模型構(gòu)建與分組 創(chuàng)傷大鼠模型構(gòu)建：SD大鼠飼養(yǎng)適應(yīng)1周后開始行手術(shù)，術(shù)前禁食12 h，1%氯胺酮麻醉，俯臥后備皮消毒，切開大鼠雙側(cè)后肢髖關(guān)節(jié)周圍皮膚，分離結(jié)扎雙側(cè)股動(dòng)脈、股靜脈，于髖關(guān)節(jié)處行雙側(cè)股骨離斷術(shù)，縫合創(chuàng)面皮膚。將大鼠仰臥，切開腹部皮膚，在胃部前壁植入帶側(cè)無(wú)菌孔硅膠管(外徑1.5 mm)，荷包縫合固定，經(jīng)腹部皮膚隧道孔穿出，固定于大鼠肩胛部皮膚，連接輸液裝置。

分組：40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，A組為正常對(duì)照組，大鼠未做手術(shù)。B組為創(chuàng)傷對(duì)照組，C組早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組，術(shù)后當(dāng)日6 h后開始給予腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，D組為延遲腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組，術(shù)后次日開始給予腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)。

1.4 營(yíng)養(yǎng)實(shí)施方案 采用士強(qiáng)作為標(biāo)準(zhǔn)腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，該營(yíng)養(yǎng)劑能量為4.18 kJ/mL，喂養(yǎng)前臨時(shí)用溫水混勻，將營(yíng)養(yǎng)液熱量密度控制為6.27 kJ/mL，使大鼠按照總熱量752.4 kJ/(kg·d)計(jì)算。創(chuàng)傷后從營(yíng)養(yǎng)管注入。A組：代謝籠中正常進(jìn)食，能量與營(yíng)養(yǎng)液相當(dāng)。B組：代謝籠中正常進(jìn)食，創(chuàng)傷后6 h開始喂食，能量與營(yíng)養(yǎng)液相當(dāng)。C組：創(chuàng)傷后6 h開始從營(yíng)養(yǎng)管灌喂士強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)液，每天2次(10∶00和17∶00)。術(shù)后第1天給予標(biāo)準(zhǔn)熱量的1/3，第2天給予標(biāo)準(zhǔn)熱量的1/2，從第3天起給予全量，連續(xù)喂養(yǎng)7 d。D組：創(chuàng)傷第2天開始灌喂士強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)液，給予標(biāo)準(zhǔn)熱量的1/3，第3天給予標(biāo)準(zhǔn)熱量的1/2，第4天起給予全量，連續(xù)喂養(yǎng)7 d。

1.5 檢測(cè)方法和指標(biāo) 于實(shí)驗(yàn)前1 d及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在無(wú)菌條件下采集血標(biāo)本。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+水平；使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)β-EP、TNF-α、IL-10水平，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書操作。

2 結(jié)果

2.1 早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)創(chuàng)傷后大鼠淋巴細(xì)胞亞群的影響 結(jié)果顯示，四組CD8+細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B組術(shù)后CD4+細(xì)胞數(shù)量與CD4+/CD8+比值顯著低于A組(P<0.05)；C組和D組CD4+與CD4+/CD8+比值相對(duì)于A組均有下降(P<0.05)，但均高于B組(P<0.05)；C組CD4+與CD4+/CD8+比值顯著高于D組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠T細(xì)胞表型含量變化

注：*與A組比較，P<0.05(*1t=-5.181，*2t=-3.219，*3t=-1.841,*4t=-2.219，*5t=-4.325,*6t=-2.267)；#與D組比較，P<0.05(#1t=2.985,#2t=1.837)

2.2 早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)創(chuàng)傷后大鼠炎性細(xì)胞因子的影響 結(jié)果顯示，與A組比較，B組β-EP、TNF-α、IL-10均顯著升高(P<0.05)。與B組比較，C組和D組β-EP、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)，IL-10顯著升高(P<0.05)。與D組比較，C組β-EP、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)，IL-10顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組術(shù)后β-EP、TNF-α、IL-10水平比較

注：*與A組比較，P<0.05(*1t=18.010，*2t=21.537，*3t=16.327，*4t=-16781，*5t=-12.346，*6t=9.846，*7t=-12.343，*8t=-11.325，*9t=9.584；*與D組比較，P<0.05(#1t=-11.232，#2t=-9.346，#3t=11.034)

3 討論

創(chuàng)傷是各種機(jī)械因素對(duì)人體組織或器官的損壞，創(chuàng)傷后可使機(jī)體出現(xiàn)代謝和免疫功能紊亂[5]。炎癥反應(yīng)是創(chuàng)傷后機(jī)體早期變化之一，嚴(yán)重的創(chuàng)傷后過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng)是機(jī)體損傷的重要機(jī)制，主要表現(xiàn)為全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)，機(jī)體呈高分解代謝狀態(tài)，以及多器官功能衰竭(MODS)、休克、膿毒癥等創(chuàng)傷后并發(fā)癥的發(fā)生[6-7]。深入研究創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)機(jī)制，可為創(chuàng)傷后全身性損害及并發(fā)癥的防治提供新的思路和方法。

本研究選取的β-EP、TNF-α、IL-10分別是創(chuàng)傷炎癥反應(yīng)過(guò)程中具有代表性的生物活性調(diào)節(jié)因子、促炎及抗炎細(xì)胞因子，可對(duì)創(chuàng)傷后炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行綜合而有效的評(píng)估。其中β-EP屬于內(nèi)源性阿片肽，由腦下垂體和丘腦下部所分泌的一種氨基化合物，生理情況下其與機(jī)體的鎮(zhèn)痛、情緒、應(yīng)激、免疫功能、胃腸道活動(dòng)的調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)的抑制等有關(guān)，在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮雙向聯(lián)系的作用[8-9]。Maddila等[10]研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后大鼠血漿β-EP水平的升高及恢復(fù)的時(shí)間與創(chuàng)傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)。研究顯示，β-EP可增強(qiáng)兔腦出血模型單核細(xì)胞IL-1、IL-2、IL-8的表達(dá)，且表現(xiàn)出了與免疫功能變化一致的趨勢(shì)[11]。TNF-α是一種炎癥反應(yīng)啟動(dòng)因子，由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種引起組織損傷的重要促炎因子[12-13]。IL-10是目前發(fā)現(xiàn)的一種強(qiáng)效抗炎細(xì)胞因子，主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，主要生理功能是抑制TNF-α、IL-6、IL-8等多種炎性細(xì)胞因子的活性，抑制集落刺激因子的合成，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)[14-15]。筆者對(duì)β-EP、TNF-α、IL-10進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后大鼠β-EP、TNF-α、IL-10水平均顯著高于正常對(duì)照組，提示β-EP、TNF-α、IL-10均參與了創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)過(guò)程。

創(chuàng)傷后的機(jī)體往往伴隨嚴(yán)重的免疫功能紊亂，且免疫抑制程度與SIRS和創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。Hua等[16]研究發(fā)現(xiàn)，重度顱腦損傷的大鼠72 h內(nèi)可迅速發(fā)生免疫功能抑制，Th細(xì)胞(CD4+)、自然殺傷細(xì)胞(NK)顯著減少，Th細(xì)胞與Ts細(xì)胞(CD4+/CD8+)比值降低，淋巴因子激活殺傷細(xì)胞活力下降。本研究顯示，與正常對(duì)照組大鼠比較，創(chuàng)傷對(duì)照組大鼠CD4+細(xì)胞數(shù)量與CD4+/CD8+比值顯著降低。提示創(chuàng)傷后大鼠確實(shí)存在免疫功能紊亂，與鄧秋林等[17]的研究一致。

腸道是體內(nèi)最大的免疫器官，創(chuàng)傷可導(dǎo)致腸道黏膜屏障損傷，腸黏膜細(xì)胞能量代謝障礙，腸蠕動(dòng)減弱或停滯，腸黏膜黏液分泌較少，細(xì)菌移位[18]。本研究結(jié)果提示，經(jīng)腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)治療后，早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組和晚期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組β-EP、TNF-α水平均顯著降低，IL-10顯著升高，CD4+與CD4+/CD8+比值均得到改善。表明腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)通過(guò)有效調(diào)節(jié)機(jī)體促炎和抗炎反應(yīng)，減輕過(guò)度炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷，同時(shí)提示腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)是一種改善機(jī)體免疫狀態(tài)、控制感染的最簡(jiǎn)單有效的方法。這可能與士強(qiáng)中含有谷氨酰胺、精氨酸、ω-3不飽和脂肪酸等物質(zhì)有關(guān)。谷氨酰胺可促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分化和增殖，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答、抗原識(shí)別和提呈，以及各類細(xì)胞因子的合成。精氨酸可刺激淋巴細(xì)胞的增殖，促進(jìn)一氧化氮的合成，并可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。ω-3不飽和脂肪酸可增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，影響受體和配體的形成和結(jié)合、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的生成和釋放，同時(shí)還可以通過(guò)降低PGE2、TXA2等花生四烯酸衍生物的合成來(lái)減輕機(jī)體炎性反應(yīng)[19-20]。而早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)比晚期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)更能改善機(jī)體的免疫功能，減輕機(jī)體免疫反應(yīng)，這與早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)腸道神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂的調(diào)節(jié)，早期腸黏膜有效的刺激，腸道血液灌流的改善和腸黏膜細(xì)胞能量代謝的增強(qiáng)有關(guān)。當(dāng)然也有不贊成早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的觀點(diǎn)，主要擔(dān)心創(chuàng)傷早期腸道水腫、充血嚴(yán)重，運(yùn)動(dòng)和吸收功能較差，早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)會(huì)增加胃腸道負(fù)擔(dān)，不利于疾病的康復(fù)。筆者認(rèn)為，早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)應(yīng)該循序漸進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)中首日給予標(biāo)準(zhǔn)劑量的1/3，次日給予1/2，第3日才給予全量。早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的目的是在及時(shí)補(bǔ)充各類能量物質(zhì)的同時(shí)，盡早給予胃腸道適宜的有效刺激，改善神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，調(diào)節(jié)腸道功能。

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