季澤娟，張春旭，郭占豪，劉方娜，劉 鑫

0 引言

骨質(zhì)疏松屬于全身代謝性疾病，調(diào)查顯示，在50歲以上人群中其發(fā)病率為50%，發(fā)病后骨折給患者帶來長期慢性疼痛，嚴重影響患者生活質(zhì)量，因此，探究其機制對于骨病的治療十分重要[1]。氧化應(yīng)激反應(yīng)和機體大多數(shù)疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，有研究顯示，氧化應(yīng)激反應(yīng)與骨質(zhì)疏松疾病間存在密切聯(lián)系，參與骨質(zhì)疏松發(fā)展過程[2]。竹葉黃酮是從竹葉中提取的有效成分，具有提高免疫力、抗菌、抗氧化、抗衰老、保護心腦血管的功效[3]。本研究以M3T3-E1細胞作為研究對象，制備細胞H2O2氧化損傷模型，通過不同生物學檢測方法探究竹葉總黃酮對M3T3-E1細胞的保護作用，以及與Nox4蛋白間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 M3T3-E1成骨細胞購自于中國科學院細胞庫。

1.2 儀器與試劑 竹葉總黃酮購自中美華東杭州有限公司，含量為92%，CO2培養(yǎng)箱購自Forma Scientific公司，低溫離心機、蛋白凝膠成像儀購自Bio-Red公司，胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Amresco公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒、堿性磷酸酶染色劑購自碧云天公司；ALP檢測試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、茜素紅購自美國Sigma公司；2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購自寶生物工程(大連)有限公司。兔抗鼠Nox4抗體均購自美國Gibco公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二體購自美國R&D公司；RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 M3T3-E1細胞培養(yǎng) M3T3-E1細胞常溫下解凍后，加入5 mL PBS緩沖液洗滌，添加0.2%胰蛋白酶進行消化后，于α-MEM培養(yǎng)基中終止消化，加入10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液，移液槍吹打培養(yǎng)液使細胞密度為106個/m3，置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當細胞貼壁生長達到80%時，加入胰蛋白酶消化，用α-MEM培養(yǎng)基洗滌3次，800 r/min離心3 min，收集細胞。按照1∶3比例進行傳代培養(yǎng)，第3代細胞用于后續(xù)研究。

1.3.2 實驗分組 將細胞分為5組，正常組：正常培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；損傷組：正常培養(yǎng)48 h后加入150 μmol/L H2O2溶液繼續(xù)培養(yǎng)；藥物處理組：在培養(yǎng)基中添加50 μg/mL竹葉總黃酮提取物培養(yǎng)M3T3-E1細胞48 h，加入同等量H2O2溶液誘導培養(yǎng)4 h；空白轉(zhuǎn)染組：MC3T3-E1細胞轉(zhuǎn)染NC siRNA后加入150 μmol/L H2O2溶液；NOX4轉(zhuǎn)染組(E組)：MC3T3-E1細胞轉(zhuǎn)染NOX4 siRNA后加入150 μmol/L H2O2溶液。

1.3.3 細胞上清液中SOD、MDA、LDH、ROS含量測定 收集培養(yǎng)后的細胞，離心后保留上清，加入PBS溶液清洗，按照SOD、MDA、LDH檢測試劑盒進行測定。在細胞上清液中加入濃度為10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針溶液，在37 ℃孵育20 min，PBS洗滌細胞，采用多功能酶標儀檢測熒光強度。

1.3.4 鈣結(jié)節(jié)染色、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色 鈣結(jié)節(jié)染色：培養(yǎng)后的細胞用PBS溶液清洗后置于70%乙醇中固定1 h，加入PBS溶液清洗3次，加入配置好的茜紅素染色劑染色30 min，PBS清洗后，置于顯微鏡下觀察記錄。ALP染色：細胞培養(yǎng)后，用PBS溶液進行清洗，消化離心后保留細胞沉淀，加入培養(yǎng)基重懸細胞，接種于放置載玻片中，隨后采用鈣鈷法進行染色，操作方法：PBS溶液沖洗玻片后進入冷丙醇中10 min，流水沖洗3次，每次3 min，加入ALP孵育液，37 ℃孵育4 h，蒸餾水沖洗2 min，加入2%硝酸鈷溶液37 ℃孵育5 min，蒸餾水洗5 min，加入1%的硫化銨中2 min。加入中性樹脂進行封片，置于100倍顯微鏡下，進行細胞計數(shù)。ALP活性檢測：細胞采用ALP活性檢測試劑盒進行測定，具體操作按照說明書進行。ALP活性率(%)=活性細胞數(shù)量/細胞總數(shù)×100%。

1.3.5 MTT法檢測M3T3-E1細胞活力 將生長至對數(shù)期的M3T3-E1細胞接種于α-MEM培養(yǎng)基中，制備細胞懸浮液提縱橫細胞密度為5×104/個，各組細胞按照“1.3.2”項培養(yǎng)結(jié)束后加入20 μL MTT，37 ℃反應(yīng)4 h，去除細胞上清液后加入200 μL DMSO，37 ℃孵育20 min，于波長490 nm下測定各組的濃度，細胞存活率=OD實驗組/OD空白組×100%。

1.3.6 流式細胞儀檢測M3T3-E1細胞凋亡情況 將培養(yǎng)后的細胞制備單細胞懸浮液，密度調(diào)整為103個/m3，加入PBS溶液洗滌，陰性對照組僅添加200 μL DMSO溶液；正常組、損傷組、處理組、轉(zhuǎn)染組、空白轉(zhuǎn)染組：加入100 μL DMSO和20 μL PI，避光反應(yīng)20 min，采用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

1.3.7 Western blot檢測Nox4蛋白的表達 收集處理后的細胞液提取細胞總蛋白，BCA法測定提取后蛋白的濃度，配制8%、12%的分離膠與濃縮膠，取30 μg蛋白進行上樣，蛋白Marker 5 μL，樣品進入濃縮膠電壓設(shè)置為80 V，進入分離膠后電壓為120 V，反應(yīng)結(jié)束將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入脫脂牛奶進行封閉4 h，加入一抗(兔抗鼠Nox4單抗)4 ℃震蕩過夜，加入PBS溶液清洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫下反應(yīng)2 h，加入PBS溶液清洗3次，每次10 min。將蛋白凝膠用EXL發(fā)光后，在暗室中曝光，利用凝膠成像儀對Western blot產(chǎn)生的條帶進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 細胞上清液中SOD、MDA、LDH、ROS含量測定 與正常組、藥物處理組、NOX4轉(zhuǎn)染組比較，損傷組、空白轉(zhuǎn)染組SOD含量降低，MDA、LDH、ROS含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；正常組、藥物處理組、NOX4轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 ALP染色、鈣結(jié)節(jié)染色結(jié)果 ALP染色顯示，與正常組比較，損傷組、空白轉(zhuǎn)染組成骨細胞大量損傷，數(shù)量明顯減少，藥物處理組、NOX4轉(zhuǎn)染組細胞損傷程度小于損傷組，細胞數(shù)量有所增加。茜紅素染色顯示，損傷組細胞鈣結(jié)節(jié)數(shù)量少于正常組，藥物處理組、NOX4轉(zhuǎn)染組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量多于損傷組；與損傷組、空白轉(zhuǎn)染組比較，正常組、藥物處理組、NOX4轉(zhuǎn)染組ALP活性升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；正常組、藥物處理組、NOX4轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、圖2。

表1 各組細胞上清液中SOD、MDA、LDH、ROS含量對比

注：與損傷組、空白轉(zhuǎn)染組比較，*P<0.05

圖1 各組M3T3-E1成骨細胞ALP染色、鈣結(jié)節(jié)染色

圖2 各組ALP活性對比

2.3 M3T3-E1細胞活力測定與凋亡情況 MTT測定結(jié)果顯示，損傷組細胞活力明顯降低，藥物處理組、NOX4轉(zhuǎn)染組細胞活力增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。流式細胞儀檢測顯示，A組細胞未出現(xiàn)大量凋亡，損傷組、空白轉(zhuǎn)染組細胞出現(xiàn)大量凋亡，藥物處理組、NOX4轉(zhuǎn)染組凋亡細胞數(shù)量降低，見圖4。

圖3 MTT法測定M3T3-E1細胞活性

圖4 各組M3T3-E1細胞凋亡情況

2.4 Nox4蛋白的表達情況 蛋白灰度掃描結(jié)果顯示，與正常組、藥物處理組、NOX4轉(zhuǎn)染組比較，損傷組、空白轉(zhuǎn)染組M3T3-E1細胞Nox4蛋白相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥發(fā)病原因主要為成骨細胞與破骨細胞的不平衡，最新研究發(fā)現(xiàn)，機體抗氧化能力降低能夠促進骨吸收，此外，氧化應(yīng)激也是導致較多退化性疾病，如骨質(zhì)疏松、衰老的重要誘因，氧化應(yīng)激失調(diào)能夠損傷骨，破壞細胞內(nèi)成分，進而加速骨質(zhì)疏松的進程，因此，研究成骨細胞氧化應(yīng)激機制對于預防骨質(zhì)疏松十分重要[4-5]。

目前，研究氧化應(yīng)激的實驗方法主要有動物法、生化檢測法和細胞模型法[6]。國外學者研究發(fā)現(xiàn)，在制備后的大鼠氧化損傷模型中，由于受到實驗周期、動物生存率等因素的影響，會給實驗結(jié)果帶來較大的誤差[7]。ABTS、DPPH是常用的化學檢測方法，操作簡便、檢測迅速，在對抗氧化劑氧化能力測定方面效果較好，但無法對機體內(nèi)氧化能力進行準確測定[8]。細胞模型能夠模擬機體內(nèi)部環(huán)境，且試驗周期較短[9]。本研究采用細胞模型在細胞水平上對氧化機制進行深入探究。H2O2化學性質(zhì)穩(wěn)定且容易獲取，國外有學者通過制備H2O2細胞損傷模型，探究細胞內(nèi)ROS、MDA變化以及對細胞活性的影響[10]，通過制備H2O2細胞損傷模型，探究蝦青素對損傷細胞的保護作用[11]。參照相關(guān)文獻中H2O2處理濃度最佳值為150 μmol/L，細胞內(nèi)相關(guān)蛋白酶以及氧化物積累最多[12]，因此，選擇150 μmol/L H2O2處理4 h。研究顯示，H2O2處理使細胞損傷后，能夠明顯降低成骨細胞數(shù)量，提高破骨細胞活性，降解骨基質(zhì)，加重病情程度，細胞中氧化自由基數(shù)量升高，與細胞膜中不飽和脂肪酸結(jié)合后生成MDA，因此，測定MDA能夠反映細胞損傷程度[13-14]。SOD主要作用為增強機體過氧化能力，消除氧自由基，通過將超氧陰離子還原為過氧化氫，轉(zhuǎn)變?yōu)樗档腕w內(nèi)自由基的含量[15]。LDH主要參與機體糖類氧化能量代謝，其數(shù)值的改變反映機體能量的變化以及細胞活力的變化[16]。機體內(nèi)ROS水平過高導致脂類氧化反應(yīng)加劇，細胞生物膜遭到破壞，逐漸老化、衰亡，此外，還能夠使蛋白酶失活[17]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，損傷組SOD含量降低，MDA、LDH、ROS含量升高，經(jīng)過竹葉總黃酮處理后SOD含量升高，MDA、LDH、ROS含量降低，表明成骨細胞損傷與細胞過氧化能力增強、氧自由基清除力下降有關(guān)，而在給予竹葉總黃酮處理后，細胞損傷程度明顯降低，提示竹葉總黃酮能降低細胞過氧化能力，提高氧自由基清除力，進而發(fā)揮對成骨細胞的保護作用。研究顯示，竹葉總黃酮處理后，能夠先后提高細胞活力及細胞內(nèi)CAT、SOD水平，降低細胞內(nèi)ROS、MDA水平，提示在細胞氧化損傷中具有一定的抗氧化作用，本研究結(jié)果與之相符合[18]。

國內(nèi)外較多研究均證明，NADPH氧化酶在調(diào)控細胞增殖、凋亡以及細胞內(nèi)ROS的生成方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。NOX-4屬于NADPH氧化酶中的一個亞型，主要表達于血管內(nèi)皮細胞中，研究顯示，通過抑制NOX-4活性，能夠降低細胞氧化應(yīng)激中細胞內(nèi)皮的損傷[20]。研究表明，NOX-4是內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激以及功能失衡的重要因子，阻斷NOX-4蛋白的表達能夠明顯減輕對細胞的氧化損傷[21]。研究顯示，Nox4與氧化應(yīng)激引起的股骨頭壞死相關(guān)，Nox-ROS信號途徑是股骨頭壞死重要的發(fā)病機制[22]。本研究結(jié)果顯示，阻斷Nox4蛋白表達后，SOD含量明顯升高，MDA、LDH、ROS含量明顯降低。且ALP染色顯示，轉(zhuǎn)染NOX4，siRNA細胞損傷程度降低，成骨細胞數(shù)量明顯升高，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量也明顯增加，與竹葉總黃酮處理后結(jié)果相似。ALP與鈣結(jié)節(jié)染色是評價細胞成骨能力的重要檢測方法，研究表明，ALP是成骨細胞中重要的膜結(jié)合蛋白，能夠分解磷酸化合物產(chǎn)生磷酸鹽離子，進而與鈣離子反應(yīng)生成羥磷灰石，聚集于骨組織中，茜紅素能使富含鈣離子的物質(zhì)著色[23]。本研究結(jié)果顯示，ALP染色后，轉(zhuǎn)染組與竹葉總黃酮處理組細胞數(shù)量增多，表明在阻斷NOX4或添加竹葉總黃酮處理后細胞成骨能力增加，且茜紅素染色也顯示鈣結(jié)節(jié)數(shù)量增多，進一步說明阻斷NOX4或添加竹葉總黃酮處理后，能夠保護細胞氧化損傷，促進骨形成。研究表明，細胞經(jīng)過H2O2處理后會發(fā)生早期凋亡，明顯抑制細胞增殖活性[24]。本研究細胞流式儀檢測結(jié)果表明，細胞氧化損傷后，出現(xiàn)明顯凋亡，而阻斷NOX4或添加竹葉總黃酮處理后，細胞凋亡明顯降低，表明竹葉總黃酮對細胞氧化損傷引起的凋亡具有一定的保護作用，而且可能與阻斷NOX4相關(guān)。蛋白檢測結(jié)果顯示，阻斷NOX4或添加竹葉總黃酮處理后，NOX4蛋白表達量均明顯升高，這可能是由于細胞經(jīng)過H2O2處理氧化損傷后，細胞內(nèi)DNA鏈斷裂，導致復制、轉(zhuǎn)錄水平降低，因此，蛋白水平也因之降低。

本研究設(shè)計存在一定的缺陷，在進行干預H2O2處理中，并未設(shè)計多個時間點進行觀察，可能對研究結(jié)果造成一定的誤差，后續(xù)應(yīng)深入研究。綜上所述，竹葉總黃酮對H2O2誘導的成骨細胞氧化損傷具有一定的保護作用，其機制可能與抑制Nox4蛋白表達有關(guān)。

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