項(xiàng)協(xié)隆 ，邵思思 ，陳宇 ，陳春 ，董飛俠

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江 溫州 325000；2.溫州老年病醫(yī)院，浙江 溫州 325000

膜性腎病(Membranous nephropathy，MN)是成人腎病綜合征的主要病理類型之一，在我國(guó)約占原發(fā)性腎病綜合征的20%，近年來(lái)發(fā)病率逐漸升高[1]。足細(xì)胞損傷是MN發(fā)病的關(guān)鍵，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic recticulum stress，ERS)是足細(xì)胞發(fā)生凋亡的最重要機(jī)制之一。黃芪具有益氣健脾、補(bǔ)中、利尿等功效，是治療MN的常用中藥，其重要成分黃芪甲苷(astragalosideⅣ)具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、保護(hù)組織器官、降低血糖、抗細(xì)胞凋亡和抗炎抗病毒等多方面作用[2]，體外實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)黃芪甲苷對(duì)補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷有保護(hù)作用[3]，但對(duì)MN的具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)觀察黃芪甲苷對(duì)被動(dòng)型海曼(Heymann)腎炎大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、磷酸化蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(phosphorylated protein kinase R-like ER kinase，p-PERK)、磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(phosphorylated eukaryotic initiation factor 2 alpha，peIF2α)等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)的影響，進(jìn)一步明確黃芪甲苷對(duì)被動(dòng)型Heymann腎炎的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠40只，體質(zhì)量170～200 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，合格證編號(hào)：2015000535634，于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，保持(50±5)%相對(duì)濕度，25℃恒溫，人工光照，明暗各12 h，自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑 鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥有限公司，批號(hào)：X2445)，黃芪甲苷(純度98%，成都錦泰和醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：160802)。羊抗大鼠Fx1A抗體血清(Probetex inc.，批號(hào)：169-06G)， p-PERK 抗 體(Santa， 貨 號(hào) ： sc32577)，p-eIF2α抗體(Santa，貨號(hào)：sc101670)，GRP78抗體(Santa，貨號(hào)：sc376768)，GAPDH抗體(聯(lián)科生，貨號(hào)：MAB5465)，兔二步法檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：PV-6001)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司)，ECL Plus發(fā)光試劑盒(碧云天公司)。

1.3 主要儀器 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(TGL-16M，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)，顯微鏡(BX43型，OLYMPUS公司)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(PYXDHS500BS-Ⅱ型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)，酶標(biāo)儀(SPECTRA max Plus 384，Molecular Devices公司)，電泳儀(Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD公司)，凝膠成像儀(ChemiDoc XRS+System，Bio-RAD公司)。

1.4 模型制備及分組給藥 40只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始試驗(yàn)，期間人工光照，明暗各12 h，自由飲水進(jìn)食。將大鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、模型組、黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷高劑量組以及貝那普利組，每組8只。除正常對(duì)照組外，其他各組大鼠均尾靜脈注射羊抗大鼠Fx1A抗體血清，劑量為6 mL/kg，正常對(duì)照組尾靜脈注射等量生理鹽水。1周后使用代謝籠收集大鼠尿液檢測(cè)24 h尿蛋白定量，除正常對(duì)照組外，其他各組大鼠24 h尿蛋白定量均大于20 mg，用于后續(xù)試驗(yàn)。黃芪甲苷低、高劑量組分別按5、10 mg/(kg·d)灌胃給藥，貝那普利組按10 mg/(kg·d)予鹽酸貝那普利灌胃，正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。所有大鼠連續(xù)灌胃4周，每周測(cè)體質(zhì)量1次并調(diào)整給藥量，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.6 生化指標(biāo)檢測(cè) 24 h尿蛋白定量及血清白蛋白采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.7 腎組織病理觀察及免疫組織化學(xué)檢查 取大鼠腎組織按常規(guī)方法制作石蠟切片，行PASM染色后光鏡觀察腎小球基底膜、系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)等。免疫組化檢查采用3 μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸鹽緩沖液中高壓煮沸抗原修復(fù)，3%H2O2室溫孵育20 min，滴加山羊血清封閉液封閉30 min，分別滴加p-PERK 抗體(1∶50)，p-eIF2α 抗體(1∶50)，4℃過(guò)夜。滴加聚合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，400倍視野下，每張切片隨機(jī)取5個(gè)非重疊視野拍照；Image Pro Plus 6.0軟件分析每張照片中陽(yáng)性染色面積的平均積分吸光度值，取其平均值進(jìn)行分析。

1.8 Western Blot法檢測(cè)大鼠腎臟GRP78蛋白的表達(dá) 取80 mg腎組織剪碎后加入1 mL組織裂解液，在冰上勻漿后，4℃離心機(jī)11 000 rpm離心10 min后取上清液。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。配置分離膠及濃縮膠，以60 μg上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，一抗GRP78抗體(1∶500)，4℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h后ECL熒光顯色。用GAPDH作為內(nèi)參檢測(cè)GRP78蛋白條帶掃描灰度變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，皮毛光澤，反應(yīng)靈敏，進(jìn)食正常，無(wú)皮下水腫。其他組大鼠在注射羊抗大鼠Fx1A抗體血清后即刻出現(xiàn)精神狀態(tài)萎靡，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食明顯減少，在注射第2、3天后緩慢恢復(fù)。模型組及黃芪甲苷低劑量組大鼠出現(xiàn)皮毛暗淡及皮下水腫；而黃芪甲苷高劑量組以及貝那普利組大鼠介于正常對(duì)照組和模型組之間。

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白定量及血清白蛋白比較見(jiàn)表1。模型組大鼠24 h尿蛋白定量較正常對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)，并隨著時(shí)間推移蛋白尿逐漸增多，至4周后達(dá)到高峰。在給藥4周后，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清白蛋白明顯降低(P＜0.05)。與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組及貝那普利組大鼠24 h尿蛋白顯著減少，血清白蛋白顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量及血清白蛋白比較(±s)

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量及血清白蛋白比較(±s)

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別2 4 h尿蛋白定量(m g/2 4 h)血清白蛋白(g/L)正常對(duì)照組模型組黃芪甲苷低劑量組黃芪甲苷高劑量組貝那普利組n 8 8 8 8 8給藥1 w 1 4.9 7±3.3 7 6 4.4 0±1 0.0 2①6 2.4 9±8.5 8 6 8.9 2±7.1 8 6 5.7 4±6.6 1給藥2 w 1 8.7 7±4.9 4 1 0 0.5 4±1 1.2 4①9 5.3 2±8.9 7 9 2.3 6±8.4 7 8 9.5 1±7.5 6給藥4 w 1 7.0 2±1.2 6 1 2 0.1 6±1 7.4 7①1 1 0.1 7±1 8.5 9 8 5.9 4±9.7 3②8 0.0 2±8.3 1②4 8.6 0±7.3 5 3 3.1 0±2.6 9①3 4.9 7±2.1 4 4 0.9 3±3.8 8②4 1.4 5±4.1 2②

2.3 各組大鼠腎組織PASM染色結(jié)果比較 見(jiàn)圖1。PASM染色光鏡下觀察顯示，正常對(duì)照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，腎小球基底膜無(wú)增厚，不伴有系膜增生。模型組及黃芪甲苷低劑量組大鼠腎小球基底膜僵硬增厚，伴有系膜增生。與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組與貝那普利組大鼠病理改變明顯減輕。

施工所需的原料一旦進(jìn)入施工場(chǎng)地就需要展開檢查工作。如原料形狀和尺寸，及基本性能，如果原料有特殊要求還必須查看相關(guān)原料的質(zhì)量證明文書，文件上要有生產(chǎn)日期等等。進(jìn)到施工現(xiàn)場(chǎng)的原料還需要進(jìn)行復(fù)檢，在第一次復(fù)檢不過(guò)關(guān)的情況下需要根據(jù)原料檢測(cè)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行再次復(fù)檢。另外檢測(cè)工作還需要監(jiān)理人員到現(xiàn)場(chǎng)參與監(jiān)督工作，要求取兩分樣品進(jìn)行檢測(cè)工作，只有檢測(cè)合格才能進(jìn)入施工現(xiàn)場(chǎng)和投入到施工中。如果施工原料在進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)完全不符使用規(guī)格就需要對(duì)原料進(jìn)行處理，并通知監(jiān)督工作人員到現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行處理。

圖1 各組大鼠腎組織PASM染色病理結(jié)果 (×400)

2.4 各組大鼠腎組織p-PERK及p-eIF2α表達(dá)比較見(jiàn)表 2、圖 2。正常對(duì)照組大鼠可見(jiàn) p-PERK、p-eIF2α在腎小球及腎小管少量表達(dá)。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎小管及腎小球p-PERK、p-eIF2α表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組及貝那普利組大鼠p-PERK、p-eIF2α表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠腎組織p-PERK及p-eIF2α表達(dá)比較(±s)

表2 各組大鼠腎組織p-PERK及p-eIF2α表達(dá)比較(±s)

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常對(duì)照組模型組黃芪甲苷低劑量組黃芪甲苷高劑量組貝那普利組n 8 8 8 8 8 p-P E R K 2 5.4 4±5.1 3 1 1 0.1 5±1 4.3 2①1 0 5.4 1±1 2.5 4 5 0.8 7±9.6 4②5 2.6 3±8.3 4②p-e I F 2 α 2 7.3 7±4.9 5 8 0.8 1±1 1.4 2①7 5.6 4±9.8 2 4 8.1 4±5.4 3②4 5.3 4±6.7 6②

2.5 各組大鼠腎組織GRP78蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表3、圖3。正常對(duì)照組大鼠腎臟組織GRP78少量表達(dá)。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠GRP78表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組及貝那普利組大鼠GRP78表達(dá)顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；黃芪甲苷低劑量組較模型組GRP78表達(dá)雖有下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

圖2 各組大鼠腎組織p-PERK、p-eIF2α表達(dá)情況 (×400)

表3 各組大鼠腎組織GRP78蛋白表達(dá)比較(±s)

表3 各組大鼠腎組織GRP78蛋白表達(dá)比較(±s)

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常對(duì)照組模型組黃芪甲苷低劑量組黃芪甲苷高劑量組貝那普利組n 8 8 8 8 8 G R P 7 8 0.3 8±0.0 2 0.8 1±0.2 6①0.6 8±0.1 7 0.5 2±0.0 8②0.4 5±0.0 5②

圖3 各組大鼠腎組織GRP78蛋白表達(dá)情況

3 討論

MN患病率隨著人口老齡化、腎活檢指征放寬及環(huán)境污染的加劇等原因不斷升高，其在原發(fā)性腎小球疾病中的占比亦逐漸升高[4]。被動(dòng)型Heymann腎炎大鼠是研究MN的經(jīng)典模型。MN患者腎活檢標(biāo)本研究及被動(dòng)型Heymann腎炎大鼠研究均發(fā)現(xiàn)ERS的標(biāo)志蛋白GRP78表達(dá)明顯升高，而且進(jìn)一步明確ERS是膜性腎病發(fā)病及足細(xì)胞損傷凋亡的重要病理機(jī)制[5～6]。黃芪是中醫(yī)學(xué)中的常用藥物，黃芪甲苷是其主要活性成分。研究提示，黃芪甲苷具有抗炎、降壓、降糖、心肌保護(hù)等多種藥理作用[7～8]。黃芪在膜性腎病患者的使用非常廣泛，新近研究也發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能夠緩解成人原發(fā)性腎病綜合征的足細(xì)胞損傷，減少蛋白尿[3]，但黃芪甲苷是否通過(guò)影響PERK通路中相關(guān)蛋白表達(dá)而緩解ERS減少蛋白尿尚不清楚。本研究首先通過(guò)注射羊抗大鼠Fx1A抗體血清，建立被動(dòng)型Heymann腎炎模型[9～10]，再將黃芪甲苷應(yīng)用于該模型。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠24 h尿蛋白定量明顯升高，血清白蛋白降低，腎組織PASM染色出現(xiàn)腎小球基底膜僵硬增厚及腎組織GRP78蛋白表達(dá)增多等，均提示模型組大鼠出現(xiàn)ERS且造模成功。黃芪甲苷高劑量組較模型組24 h尿蛋白定量明顯減少，血清白蛋白上升，腎組織PASM染色示病理?yè)p害減輕，腎組織GRP78蛋白表達(dá)下調(diào)，均提示高劑量黃芪甲苷能夠通過(guò)減輕ERS而有效緩解腎臟損傷。

缺血缺氧、氧化應(yīng)激、鈣濃度異常等因素導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白負(fù)荷過(guò)重引發(fā)ERS時(shí)，機(jī)體將激活一系列信號(hào)途徑過(guò)程即未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，以減少蛋白質(zhì)產(chǎn)生或者降解異常折疊蛋白質(zhì)[11]。UPR由分子伴侶GRP78和3種ERS感受器蛋白介導(dǎo)，這3種蛋白分別是PERK，轉(zhuǎn)錄激活因子6和肌醇依賴酶1，它們引導(dǎo)三種不同的信號(hào)通路，其中PERK/eIF2α信號(hào)通路為主要通路[12]。ERS啟動(dòng)時(shí)，PERK與GRP78解離后發(fā)生自身磷酸化，成為p-PERK并激活下游eIF2α使其磷酸化為p-eIF2α，從而下調(diào)幾乎所有蛋白質(zhì)的翻譯合成，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)[13]。適當(dāng)?shù)腅RS有助于維持細(xì)胞生存，但過(guò)度ERS會(huì)引導(dǎo)組織細(xì)胞發(fā)生凋亡，引起或加重疾病[14]。Chen Y等[15]發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病大鼠中，黃芪甲苷可以通過(guò)抑制腎組織ERS發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞減少蛋白尿的作用，并且進(jìn)一步了解該作用主要通過(guò)PERK/eIF2α信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，而對(duì)轉(zhuǎn)錄激活因子6和肌醇依賴酶1沒(méi)有影響。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷高劑量組大鼠GRP78、p-PERK、p-eIF2α蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，尿蛋白減少而血清白蛋白明顯上升，病理?yè)p傷減輕，提示黃芪甲苷可能通過(guò)抑制PERK/eIF2α通路減輕ERS，緩解蛋白尿，起到保護(hù)Heymann腎炎大鼠腎臟的作用，為以后黃芪甲苷在膜性腎病中的運(yùn)用提供新的視角。

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