◎ 陳慶全，曾慶祝，李紅良

（1.廣州沃邦生物科技有限公司，廣東 廣州 510000；2.廣州大學，廣東 廣州 510000）

魚糜是將魚經(jīng)過去鱗、采肉、漂洗、精濾、脫水攪拌和凍結(jié)等工藝加工，再經(jīng)擂潰或斬拌、成型、加熱和冷卻等工序制成的魚糜制品。在魚糜生產(chǎn)過程中，魚肉必須經(jīng)過2 次或2 次以上的漂洗才能去除阻礙魚糜凝膠形成和影響魚糜感官品質(zhì)的雜質(zhì)，經(jīng)過漂洗可提高魚糜的凝膠強度和白度[1]。漂洗廢水中一般含有0.5%～2.5%的蛋白質(zhì)，是值得回收利用的高價值蛋白資源[2-3]。

1 材料與儀器

牛血清白蛋白購自國藥集團化學試劑有限公司，1%海藻酸鈉溶液、1%殼聚糖溶液。

紫外分光光度計購自尤尼柯(上海)儀器有限公司。羅非魚魚糜加工漂洗液原液，取之于項目合作單位，帶回實驗室后置于冰柜中，-18 ℃冷凍備用。

2 實驗方法

2.1 以海藻酸鈉為單一絮凝劑條件優(yōu)化

2.1.1 pH 對回收漂洗液蛋白質(zhì)的影響

分別取40 mL 漂洗液加入3 mL 海藻酸鈉溶液，用1 mol·L-1HCl 溶液和1 mol·L-1NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 和6.5 靜置30 min，4 000 r·min-1離心10 min[5-6]。

2.1.2 溫度對回收漂洗液蛋白質(zhì)的影響

分別取40 mL 漂洗液置于溫度15、20、25、30、35、40、45 ℃和50 ℃下，漂洗液中分別加入3 mL 海藻酸鈉溶液靜置30 min，4 000 r·min-1離心10 min[7]。

2.1.3 時間對回收漂洗液蛋白質(zhì)的影響

分別取40 mL 漂洗液加入3 mL 褐藻膠溶液靜置10、20、30、40、50、60、70 min 和80 min，4 000 r·min-1離心10 min。

2.1.4 海藻酸鈉溶液濃度對回收漂洗液蛋白質(zhì)的影響

分 別 取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL 和5.0 mL 海藻酸鈉溶液加入40 mL 漂洗液中，pH 控制在4.5 左右靜置30 min，4 000 r·min-1離心10 min[8-9]。

2.2 以殼聚糖為單一絮凝劑條件優(yōu)化

2.2.1 pH 對回收漂洗液蛋白質(zhì)的影響

分別取40 mL 漂洗液加入3 mL 殼聚糖溶液，用1.0 mol·L-1HCl 溶液和1.0 mol·L-1NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5，靜置90 min， 4 000 r·min-1離心10 min[10]。

2.2.2 溫度對回收漂洗液蛋白質(zhì)的影響

分別取40 mL 漂洗液置于溫度15、20、25、30、35、40、45 ℃和50 ℃下，漂洗液中分別加入3 mL 殼聚糖溶液，靜置90 min，4 000 r·min-1離心10 min[11]。

2.2.3 時間對回收漂洗液蛋白質(zhì)的影響

分別取40 mL 漂洗液加入3 mL 殼聚糖溶液靜置30、50、70、90、110、130、150 min 及170 min， 4 000 r·min-1離心10 min。

2.2.4 殼聚糖溶液濃度對回收漂洗液蛋白質(zhì)的影響

分 別 取1.6、3.2、4.8、6.4、8.0、9.6、11.2 mL 和12.8 mL 殼聚糖溶液加入40 mL 漂洗液中，pH 調(diào)至7.0靜置90 min，在4 000 r·min-1離心10 min[12]。

2.3 以海藻酸鈉-殼聚糖為復合絮凝劑條件優(yōu)化

2.3.1 pH 對回收漂洗液蛋白質(zhì)的影響

分別取40 mL 漂洗液放入1.5 mL 海藻酸鈉溶液和1.5 mL 殼聚糖溶液，用1.0 mol·L HCl 溶液和1.0 mol·L NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH 為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 靜置30 min，在4 000 r·min-1離心10 min。

2.3.2 溫度對回收漂洗液蛋白質(zhì)的影響

分別取40mL 漂洗液置于溫度15、20、25、30、35、40、45、50 ℃，再取1.5 mL 海藻酸鈉溶液和1.5 mL 殼聚糖溶液分別加入后靜置30 min，在4 000 r·min-1離心10 min。

2.3.3 時間對回收漂洗液蛋白質(zhì)的影響

分別取40 mL 漂洗液放入1.5 mL 海藻酸鈉溶液和1.5 mL 殼聚糖溶液靜置10、20、30、40、50、60、70、80 min，在4 000 r·min-1離心10 min[13]。

2.3.4 復合絮凝劑濃度對回收漂洗液蛋白質(zhì)的影響

取0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6、4.2、4.8 mL 復合絮凝劑加入40 mL 漂洗液中（海藻酸鈉溶液與殼聚糖溶液的比例是1 ∶1），pH 調(diào)至6.5 靜置30 min，在4 000 r·min-1離心10 min。

2.4 等電點沉降法與絮凝法聯(lián)用條件優(yōu)化

2.4.1 單一絮凝劑分段回收蛋白質(zhì)

根據(jù)實驗方法2.1 和2.2，先以海藻酸鈉為單一絮凝劑在最佳條件（濃度為0.96 mg·mL-1，pH=4.0，時間為30 min，溫度為30 ℃）下先提取一部分蛋白，離心后收集相同體積的上清液；再以殼聚糖為單一絮凝劑在最佳條件（濃度為2.13 mg·mL-1，pH=7.0，時間為90 min，溫度為30 ℃）再提取一次蛋白，即為所謂的分段絮凝，離心后取上清液用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量，相同實驗條件下重復8 次實驗。

2.4.2 等電點沉降法與復合絮凝劑絮凝法聯(lián)用回收蛋白質(zhì)

根據(jù)相關文獻[5-6]和實驗方法2.3，先用等電點沉降法在最佳條件下回收一部分水溶性蛋白（溫度為 30 ℃，pH=5.5）離心后收集相同體積的上清液；再以復合絮凝劑絮凝法的最佳提取條件再次回收蛋白（濃度為1.03 mg·mL-1，pH=6.5，時間為30 min，溫度為35 ℃），離心后取上清液用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量，相同實驗條件下重復8 次實驗。

2.4.3 等電點沉降與單一絮凝劑分段絮凝聯(lián)用回收蛋白質(zhì)

根據(jù)相關文獻[5-6]、實驗方法2.1 和2.2，①用等電點沉降法在最佳條件下回收一部分水溶性蛋白（溫度為30 ℃，pH=5.5）離心后收集相同體積的上清液。 ②以海藻酸鈉為單一絮凝劑在最佳條件下（濃度為0.96 mg·mL-1，pH=4.0，時間為30 min，溫度為30 ℃） 先提取一部分蛋白，離心后收集相同體積的上清液。③以殼聚糖為單一絮凝劑在最佳條件下（濃度為 2.13 mg·mL-1，pH=7.0，時間為90 min，溫度為30 ℃）再提取一次蛋白，離心后取上清液用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量，相同實驗條件下重復8 次實驗。

3 分析方法

3.1 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的含量

3.1.1 蛋白質(zhì)標準曲線的測定

分別取濃度為1 mg·mL-1牛血清蛋白質(zhì)標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 和1.0 mL 于試管中，不足 1 mL 則用雙蒸水補齊至1.0 mL，各試管均分別加入4.0 mL 雙縮脲試劑，在漩渦震蕩器上振蕩混勻，室溫 （20 ～25 ℃）下反應30 min。以空白管調(diào)零，在波長540 nm，比色皿杯徑1.0 cm 下用紫外-可見光分光光度計測定吸光值（OD）。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標，以OD 為縱坐標作標準曲線。

3.1.2 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度

分別準確稱取0.5 mL 漂洗液原液和上清液于試管中，加雙蒸水至1.0 mL，再加入4.0 mL 雙縮脲試劑，室溫下靜置30 min。以空白管調(diào)零，在波長540 nm 處測定OD，依據(jù)標準曲線求得濃度值[14]。

3.2 蛋白質(zhì)回收率的計算

蛋白質(zhì)回收率按公式（1）計算：

式（1）中，ρ 為蛋白質(zhì)回收率，C 為上清液漂洗液蛋白質(zhì)濃度（mg·mL-1），C0為原漂洗液蛋白質(zhì)濃度（mg·mL-1）。

4 結(jié)果與分析

4.1 蛋白質(zhì)標準曲線

蛋白質(zhì)的標準曲線見圖1，回歸方程為y=0.048 9x+ 0.001 5，R2=0.999 5，表明蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在0 ～10 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關系良好，后續(xù)試驗中檢測蛋白質(zhì)濃度根據(jù)此標準曲線計算。

4.2 以海藻酸鈉為單一絮凝劑對蛋白質(zhì)回收率的影響

4.2.1 pH 對蛋白質(zhì)回收率的影響

結(jié)果如圖2 所示，在pH=4.0 左右時蛋白質(zhì)回收率最高，pH 超過4.0 后回收率迅速降低，海藻酸鈉與蛋白質(zhì)之間通過范德華力、氫鍵和靜電相互作用，在接近蛋白質(zhì)等電點時，呈電中性，這種作用最大[5]。

圖1 牛血清白蛋白的標準曲線圖

圖2 pH 對回收魚糜漂洗液蛋白質(zhì)的影響圖

4.2.2 溫度對蛋白質(zhì)回收率的影響

結(jié)果如圖3 所示，可知溫度對回收率的影響很小，曲線波動幅度不大，考慮到實際生產(chǎn)成本需要，取漂洗液在接近室溫30 ℃的蛋白質(zhì)回收率，50 ℃左右時會因為蛋白質(zhì)的加熱變性而導致回收率逐漸上升[4]。

圖3 溫度對回收魚糜漂洗液蛋白質(zhì)的影響圖

4.2.3 時間對蛋白質(zhì)回收率的影響

結(jié)果如圖4 所示，吸附時間持續(xù)到30 min 時蛋白質(zhì)回收效果最佳，這說明蛋白質(zhì)與海藻酸鈉的絡合作用需要一定時間，若時間過長則可能出現(xiàn)解吸附現(xiàn)象。

圖4 時間對回收魚糜漂洗液蛋白質(zhì)的影響圖

4.2.4 海藻酸鈉溶液濃度對蛋白質(zhì)回收率的影響

結(jié)果如圖5 所示，當海藻酸鈉溶液濃度增加到0.96 mg·mL-1時，繼續(xù)增加絮凝劑用量會導致蛋白回收率降低，可能是因為過高的海藻酸濃度導致漂洗液粘稠度上升，阻礙了蛋白質(zhì)的絮凝。

圖5 海藻酸鈉溶液濃度對回收魚糜漂洗液蛋白質(zhì)的影響圖

根據(jù)上述結(jié)果，綜合魚糜漂洗的實際生產(chǎn)及各影響因素，可以得出以海藻酸鈉為單一絮凝劑回收羅非魚魚糜加工漂洗液中蛋白質(zhì)的最佳條件：pH 為4.0，溫度為30 ℃，處理時間為30 min，海藻酸鈉溶液濃度為0.96 mg·mL-1，此條件下蛋白回收率可達59.58%。

4.3 以殼聚糖為單一絮凝劑對蛋白質(zhì)回收率的影響

4.3.1 pH 對蛋白質(zhì)回收率的影響

結(jié)果如圖6 所示，隨著pH 的遞增，蛋白質(zhì)的回收率增大，pH 為7.0 時，回收率最大，偏堿性時回收率會降低，pH 的改變影響了魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量，從而導致殼聚糖與蛋白質(zhì)之間的相互作用發(fā)生變化。

4.3.2 溫度對蛋白質(zhì)回收率的影響

結(jié)果如圖7 所示，升高溫度有利于加強殼聚糖與蛋白質(zhì)間的聚沉作用；當溫度超過30 ℃時，殼聚糖與蛋白質(zhì)間的吸附架橋作用和靜電吸引達到最大，50 ℃后繼續(xù)升溫會使蛋白質(zhì)變性聚沉而增加回收率。

圖7 溫度對回收魚糜漂洗液蛋白質(zhì)的影響圖

4.3.3 時間對蛋白質(zhì)回收率的影響

結(jié)果如圖8 所示，隨著時間的推移架橋作用和靜電吸附能力越來越強，蛋白質(zhì)回收率逐漸上升，但時間太長可能會出現(xiàn)脫附現(xiàn)象，90 min 最為合適。

4.3.4 殼聚糖溶液濃度對蛋白質(zhì)回收率的影響

結(jié)果如圖9 所示，當濃度增加到2.13 mg·mL-1時蛋白質(zhì)回收率達到極大值，繼續(xù)增加則會使回收率降低，可能是因為過量的殼聚糖阻礙了殼聚糖與蛋白質(zhì)之間的有效吸附。

圖8 時間對回收魚糜漂洗液蛋白質(zhì)的影響圖

圖9 殼聚糖濃度對回收魚糜漂洗液蛋白質(zhì)的影響圖

根據(jù)上述實驗結(jié)果，綜合魚糜漂洗的實際生產(chǎn)及各影響因素，可以得出以殼聚糖為單一絮凝劑回收魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)的最佳條件：pH為7.0，溫度為30 ℃，處理時間為90 min，殼聚糖溶液濃度為2.13 mg·mL-1，此條件下蛋白的回收率可達47.28%。

4.4 以海藻酸鈉-殼聚糖為復合絮凝劑對蛋白質(zhì)回收率的影響

4.4.1 pH 對蛋白質(zhì)回收率的影響

結(jié)果如圖10 所示，pH=6.5 附近接近蛋白質(zhì)的等電點，蛋白質(zhì)易絮凝沉淀，提高蛋白質(zhì)回收率。在酸性條件下，殼聚糖的氨基基團與海藻酸鈉的羧基基團發(fā)生靜電作用形成復合物，削弱了殼聚糖與蛋白質(zhì)間的聚沉作用[14]。

4.4.2 溫度對蛋白質(zhì)回收率的影響

結(jié)果如圖11 所示，當溫度低于35 ℃時，溫度的升高有利于加強分子熱運動，增大復合絮凝劑與蛋白間的作用強度，有利于增大蛋白質(zhì)回收率；當超過50 ℃ 時，蛋白質(zhì)開始變性聚沉和復合絮凝，使回收率上升。

圖10 pH 對回收魚糜漂洗液蛋白質(zhì)的影響圖

圖11 溫度對回收魚糜漂洗液蛋白質(zhì)的影響圖

4.4.3 時間對蛋白質(zhì)回收率的影響

結(jié)果如圖12 所示，在30 min 時，蛋白質(zhì)回收率最高，超過30 min后，蛋白質(zhì)回收率呈逐漸減小的趨勢，時間過長可能會出現(xiàn)脫附解離現(xiàn)象。

圖12 時間對回收魚糜漂洗液蛋白質(zhì)的影響圖

4.4.4 復合絮凝劑添加濃度對蛋白質(zhì)回收率的影響

結(jié)果如圖13 所示，隨著殼聚糖-海藻酸鈉溶液濃度的提高，蛋白質(zhì)的回收率緩慢增大，當濃度增加至1.03 mg·mL-1時，蛋白質(zhì)回收率達到極大值，繼續(xù)增加，回收率會降低，這是因為殼聚糖-海藻酸鈉絮凝劑濃度過高，增大了溶液濁度，阻止了蛋白質(zhì)與殼聚糖-海藻酸鈉絮凝劑的有效吸附。

圖13 復合絮凝劑濃度對回收魚糜漂洗液蛋白質(zhì)的影響圖

根據(jù)上述實驗結(jié)果，綜合魚糜漂洗的實際生產(chǎn)及各影響因素，可以得出以殼聚糖-海藻酸鈉溶液為絮凝劑回收魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)的最佳條件：pH 為6.5，溫度為35 ℃，處理時間為30 min，復合絮凝劑濃度為1.03 mg·mL-1，在此條件下測得蛋白的回收率可達43.13%。

4.5 等電點沉降法與絮凝法聯(lián)用對蛋白質(zhì)回收率的影響

采用以海藻酸鈉和殼聚糖為單一絮凝劑分段沉降、等電點沉降法與以海藻酸鈉-殼聚糖為復合絮凝劑絮凝法聯(lián)用、等電點沉降與分別以海藻酸鈉和殼聚糖為單一絮凝劑分段沉降絮凝聯(lián)用3 種工藝對魚糜漂洗液蛋白質(zhì)回收率結(jié)果如圖14 所示。

圖14 表明，以單一海藻酸鈉絮凝劑進行第一步沉降絮凝，海藻酸鈉與漂洗液中的部分蛋白先通過氫鍵作用聚沉；第二步用單一殼聚糖絮凝劑沉降絮凝的分段絮凝，殼聚糖與漂洗液中余下的水溶性蛋白通過靜電作用聚沉，雙重作用下可得到蛋白回收率均值為64.65%；第一步使用等電點沉降法，利用蛋白質(zhì)等電點處溶解度變差聚沉一部分蛋白，第二步使用以海藻酸鈉-殼聚糖為復合絮凝劑絮凝進行聚沉，蛋白回收率均值為57.17%；第一步使用等電點沉降法，以單一海藻酸鈉絮凝劑進行第二步沉降絮凝，第三步用單一殼聚糖絮凝劑沉降絮凝，蛋白回收率均值為65.34%。

圖14 3 種工藝回收的蛋白質(zhì)回收率比較圖

5 結(jié)論

等電點沉降法和海藻酸鈉-殼聚糖復合絮凝劑絮凝沉降聯(lián)用比海藻酸鈉-殼聚糖復合絮凝劑絮沉法蛋白質(zhì)回收率高，可能是因為等電點沉降法最為靠近魚糜漂洗液中蛋白的等電點，從而回收絮凝作用無法回收的蛋白。絮凝法中，分段絮凝比復配絮凝的蛋白質(zhì)回收率高，可能是因為殼聚糖的氨基基團與海藻酸鈉的羧基基團相互發(fā)生靜電作用形成復合物，削弱了各自與蛋白質(zhì)的聚沉作用，而以單一絮凝的形式各自分段絮凝則可避免兩種絮凝劑反應?；厥辗椒ǖ穆?lián)用比單一回收方法的蛋白回收率高，可能是因為等電點調(diào)節(jié)法，以海藻酸鈉為單一絮凝劑，以殼聚糖為單一絮凝劑和以海藻酸鈉-殼聚糖為復合絮凝劑沉降回收的蛋白分別對應漂洗液中不同分子量的蛋白，所以當各種方法聯(lián)用時可提高蛋白質(zhì)回收率。

根據(jù)上述實驗結(jié)果，和Batista I[15]等研究的等電點沉降法對魚糜漂洗液蛋白質(zhì)進行回收的5種工藝中，回收率最高的是等電點沉降與分別以海藻酸鈉和殼聚糖為單一絮凝劑分段沉降絮凝聯(lián)用，蛋白回收率均值為65.34%；以海藻酸鈉和殼聚糖為單一絮凝劑分段沉降次之，回收率均值為64.65%；以單一海藻酸鈉絮凝劑絮凝的蛋白回收率為59.58%為第三高；等電點沉降法與以海藻酸鈉-殼聚糖為復合絮凝劑絮凝法聯(lián)用的蛋白回收率均值為57.17%；最后是以單一殼聚糖絮凝劑絮凝回收漂洗液蛋白，回收率均值為47.28%。