王麗，李杰輝，張春霞，狄鉀騏，劉明，劉雪琴

糖尿病性潰瘍是糖尿病患者嚴重的并發(fā)癥之一。研究表明，15%～20%糖尿病患者在糖尿病發(fā)展進程中會出現(xiàn)足部潰瘍甚至壞疽，導致截肢率大幅提高，糖尿病性潰瘍是糖尿病患者致殘、致死的重要原因之一［1-3］。糖尿病患者皮膚存在“隱形損害”［4］，晚期糖基化終末產物（AGEs）與AGEs受體（RAGE）在內皮細胞表面結合后，會啟動一系列受體信號轉導途徑參與糖尿病創(chuàng)面愈合，其中作為炎性損傷相關的血管內皮因子，細胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子1（VCAM-1）發(fā)揮著關鍵作用［5］。濕潤燒傷膏（MEBO）目前廣泛應用于皮膚潰瘍創(chuàng)面的修復［6-7］，取得較好的臨床療效，本課題組前期發(fā)現(xiàn)其促愈機制可能與調控創(chuàng)面組織AGEs-RAGE信號轉導通路有關［8］，本研究在此基礎上觀察MEBO對糖尿病性潰瘍創(chuàng)面組織ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達及超微結構的影響，進一步探討MEBO促進糖尿病性潰瘍創(chuàng)面愈合的藥物作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠145只，SPF級，12周齡，體質量（220±30）g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心〔許可證號SCXK（桂）2009-0002〕提供。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，相對濕度（60±10）%，單籠飼養(yǎng)2周適應環(huán)境后用于實驗。本研究經廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 實驗藥品與試劑 MEBO（汕頭市美寶制藥有限公司，生產批號：400803A），鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司，生產批號：SLBH0076V），低精蛋白鋅胰島素注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，生產批號：13102312），Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司），重組牛堿性成纖維細胞生長因子（貝復濟，珠海億勝生物制藥有限公司，批號：20140403），1st Strand cDNA合成試劑盒（日本TaKaRa Bio株式會社），Power SYBR? Green PCR Master Mix（ 美 國 ABI公司）。引物設計及合成由中山大學達安基因股份有限公司完成。引物序列如下：ICAM-1上游引物：5'-CTGCAGAGCACAAACAGCAGA-3'， 下 游 引 物：5'-AAGGCCGCAGAGCAAAAGAAGC-3'；VCAM-1 上游引物：5'-TAAGTTACACAGCAGTCAAATGGA-3'，下游引物：5'-CACATACATAAATGCCGGAATCTT-3'；β-actin上游引物：5'-TCCGTAAAGACCTCTATGCC-3'，下游引物：5'-AAAGCCATGCCAAATGTCTC-3'。

1.3 實驗儀器 臺式高通量DNA合成儀（型號：3900，美國ABI公司），全自動熒光PCR儀（型號：7500，美國ABI公司），PCR儀（型號：9700，美國ABI公司），高速冷凍離心機（型號：HC-3018R，安徽中科中佳科學儀器有限公司），透射電子顯微鏡（型號：H-7650，日本日立公司），美迪信血糖儀及配套血糖試紙（天津億朋醫(yī)療器械股份有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 模型制備 2015年6月，采用隨機數字表法，將145只健康雄性SD大鼠分為空白組（35只）和糖尿病模型組（110只），糖尿病模型組制備糖尿病大鼠模型，SD大鼠給予65 mg/kg STZ腹腔注射［9］，在造模前后采用剪尾法使用血糖儀測定隨機血糖，使用電子秤每周稱量大鼠體質量。成模標準：造模前隨機血糖＜8.9 mmol/L，造模后隨機血糖≥16.7 mmol/L，大鼠體質量明顯下降，并抽取胰腺組織病理顯示胰島細胞被破壞視為造模成功。參照趙京禹等［10］方法制備糖尿病性潰瘍創(chuàng)面模型：采用3.5%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射將大鼠麻醉，呈腹臥位固定，背部脫毛，用直徑為18 mm的圓形圖章于大鼠脊柱正中距離肩胛骨下緣水平位置約2 cm處印出圓形標記，1%碘伏消毒后，根據標記剪去全層皮膚，深至筋膜，制成糖尿病性潰瘍創(chuàng)面。

1.4.2 干預方法 糖尿病造模誘導8周后，共造模成功94只，將體質量過?。ǎ?80 g）成模大鼠或體質量過大（＞350 g）空白組大鼠剔除后，剩余90只成模大鼠和30只空白組大鼠，制備糖尿病性潰瘍創(chuàng)面模型，采用隨機數字表法將成模大鼠分為模型亞組、貝復濟亞組、MEBO亞組，每組30只。模型制備成功后，根據課題組前期研究方法［8］進行干預治療，空白組及模型亞組給予0.9%氯化鈉溶液紗條、MEBO亞組給予MEBO紗條、貝復濟亞組給予貝復濟溶液紗條局部換藥處理，1次/d，共12 d。單籠飼養(yǎng)每組大鼠并自由飲食。

1.4.3 標本采集 各組分別于創(chuàng)面干預治療后第3、6、12天，每次隨機選取10只大鼠，麻醉后采集相同位點創(chuàng)面組織，一部分放置液氮中保存以備熒光聚合酶鏈式反應（PCR）檢測，一部分以2.5%戊二醛和1.0%鋨酸固定進行電鏡超微結構觀察。

1.4.4 指標檢測

1.4.4.1 創(chuàng)面組織ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達測定

取出液氮凍存的創(chuàng)面組織，根據試劑盒說明提取總RNA，將組織加入1 ml Trizol，充分振蕩，加入三氯甲烷 0.2 ml，搖動 15s，混勻，15～30 ℃孵育 2～3 min，4℃高速離心機，12 000 r/min離心15 min（離心半徑為6cm）后取上清液，加入等體積異丙醇，15～30 ℃孵育10 min，4 ℃高速離心機，12 000 r/min離心10 min（離心半徑為6 cm）后棄上清液，加入75%乙醇〔含焦碳酸二乙酯（DEPC）水〕洗滌沉淀1次，4℃高速離心機，7 500 r/min離心5 min（離心半徑為6 cm）后棄乙醇，空氣干燥5～10 min，加DEPC水溶解RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。在反轉錄體系中擴增合成cDNA，將制備好的cDNA進行PCR擴增，擴增體系如下：2×Power SYBR? Green PCR Master Mix 12.5 μl，上游引物（10 pmol/μl）0.5 μl， 下 游 引 物（10 pmol/μl）0.5 μl，cDNA 模板 2 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR 擴增條件：95 ℃預變性15 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火延伸45 s，共40個循環(huán)。以β-actin作為內參基因，實驗結果分析Ct值，采用2-△△Ct法計算mRNA相對表達量。

1.4.4.2 超微病理檢測 創(chuàng)面組織采用2.5%戊二醛和1.0%鋨酸進行固定，經過脫水以及環(huán)氧樹脂浸透和包埋，制作成60 nm的超薄組織切片，再以醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，干燥后電鏡觀察超微病理結構。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組創(chuàng)面組織ICAM-1 mRNA表達水平比較 4組干預治療后第3、6、12天創(chuàng)面組織ICAM-1 mRNA表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中，模型亞組第3天創(chuàng)面組織ICAM-1 mRNA表達水平低于空白組，第6、12天創(chuàng)面組織ICAM-1 mRNA表達水平均高于空白組（P＜0.05）；貝復濟亞組第12天創(chuàng)面組織ICAM-1 mRNA表達水平低于模型亞組（P＜0.05）；MEBO亞組第3天創(chuàng)面組織ICAM-1 mRNA表達水平高于模型亞組，第6、12天創(chuàng)面組織ICAM-1 mRNA表達水平均低于模型亞組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 4組大鼠不同時間創(chuàng)面組織ICAM-1 mRNA表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of expression level of ICAM-1 mRNA among four groups of rats at different time points

表1 4組大鼠不同時間創(chuàng)面組織ICAM-1 mRNA表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of expression level of ICAM-1 mRNA among four groups of rats at different time points

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型亞組比較，bP＜0.05；MEBO=濕潤燒傷膏

組別 只數 第3天 第6天 第12天空白組 10 1.00±0.31 1.00±0.31 1.00±0.32模型亞組 10 0.31±0.09a 4.39±0.84a 4.96±1.36a貝復濟亞組 10 0.40±0.14 3.03±0.73 3.42±1.16b MEBO 亞組 10 0.62±0.14b 2.82±1.10b 2.66±0.72b F值 25.939 30.386 28.371 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 4組創(chuàng)面組織VCAM-1 mRNA表達水平比較 4組干預治療后第3、6、12天創(chuàng)面組織VCAM-1 mRNA表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中，模型亞組第3天創(chuàng)面組織VCAM-1 mRNA表達水平低于空白組，第6、12天創(chuàng)面組織VCAM-1 mRNA表達水平均高于空白組（P＜0.05）；貝復濟亞組、MEBO亞組第3天創(chuàng)面組織VCAM-1 mRNA表達水平均高于模型亞組，第6、12天創(chuàng)面組織VCAM-1 mRNA表達水平均低于模型亞組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 4組大鼠不同時間創(chuàng)面組織VCAM-1 mRNA表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of expression level of VCAM-1 mRNA amang four groups of rats at different time points

表2 4組大鼠不同時間創(chuàng)面組織VCAM-1 mRNA表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of expression level of VCAM-1 mRNA amang four groups of rats at different time points

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型亞組比較，bP＜0.05

組別 只數 第3天 第6天 第12天空白組 10 1.00±0.43 1.00±0.48 1.00±0.31模型亞組 10 0.34±0.14a 3.83±1.07a 4.14±1.20a貝復濟亞組 10 0.56±0.16b 1.30±0.45b 1.57±0.44b MEBO 亞組 10 0.62±0.20b 1.08±0.32b 1.75±0.77b F值 11.215 43.933 33.091 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 創(chuàng)面組織超微結構病理觀察 透射電鏡觀察顯示，干預治療后第3天，空白組成纖維細胞內質網擴張，細胞器少，散在部分膠原纖維；模型亞組成纖維細胞內質網擴張，細胞中內容物少，線粒體空化，膠原生成較少；貝復濟亞組成纖維細胞內質網腫脹，線粒體空泡，散在部分膠原纖維；MEBO亞組成纖維細胞內質網擴張不明顯，線粒體基本正常，部分空泡（見圖1）。第6天，空白組內皮細胞細胞核腫脹，細胞漿內粗面內質網擴張；模型亞組內皮細胞細胞核腫脹，線粒體有空泡，內質網腫脹擴張，血管腔變窄；貝復濟亞組內皮細胞細胞核腫脹，線粒體空泡，血管腔變窄；MEBO亞組內皮細胞細胞核稍有腫脹，線粒體部分空泡，粗面內質網未見明顯擴張（見圖2）。第12天，空白組成纖維細胞內容物多，內質網數量豐富，膠原纖維生成較多；模型亞組成纖維細胞內質網擴張，線粒體空泡，核糖體少，膠原纖維生成少；貝復濟亞組成纖維細胞內質網擴張不明顯，數量豐富，膠原纖維生成較多；MEBO亞組成纖維細胞內容物較豐富，內質網未擴張，膠原纖維生成較多（見圖3）。

圖1 4組干預治療后第3天創(chuàng)面組織超微結構（×30 000，醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色）Figure 1 Ultrastructureof the wound tissue at the 3rd day after intervention

圖2 4組干預治療后第6天創(chuàng)面組織超微結構（×30 000，醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色）Figure 2 Ultrastructureof the wound tissue at the 6th day after intervention

3 討論

細胞黏附分子（CAM）是一類調節(jié)細胞與細胞、細胞與細胞外基質間相互結合、起黏附作用的膜表面糖蛋白［11］。ICAM-1、VCAM-1是血管內皮因子，均屬于CAM免疫球蛋白超家族成員，主要在成纖維細胞、血管內皮細胞及白細胞等細胞表面表達，與炎性損傷密切相關，炎性因子、氧化損傷及高糖損傷均可誘導ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達增加［12-13］。糖尿病患者體內存在大量AGEs，其與RAGE結合后，促使活性氧簇（ROS）產生，誘導氧化應激反應。異常的氧化應激水平導致糖尿病皮膚創(chuàng)傷修復起點異常，從而促進炎性反應，加重糖尿病皮膚病變。AGEs與RAGE相互作用還可激活核轉錄因子（NF-κB），進而激活一系列促炎性反應基因，誘導ICAM-1、VCAM-1轉錄與表達上調，增加血管通透性，觸發(fā)瀑布式炎性反應，導致糖尿病創(chuàng)傷創(chuàng)面持續(xù)炎性損傷，難以愈合。本研究結果顯示，在創(chuàng)面損傷第3天時，糖尿病性潰瘍大鼠模型創(chuàng)面組織ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達水平尚低，創(chuàng)面組織超微結構亦提示成纖維細胞內質網擴張，線粒體空化；創(chuàng)面損傷第6、12天時，創(chuàng)面組織ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達持續(xù)升高，呈炎性過激狀態(tài)，超微結構亦提示內皮細胞、成纖維細胞細胞核腫脹，線粒體空泡，內質網明顯腫脹擴張。既往文獻報道顯示，糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面損傷第7天，創(chuàng)面組織ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達呈上升趨勢，第14天創(chuàng)面組織中ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達明顯增加［14］。本研究檢測糖尿病性潰瘍發(fā)生后第3、6、12天創(chuàng)面組織ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達，第6、12天結果與文獻［14］基本相符，第3天創(chuàng)面組織ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達下降，提示糖尿病性潰瘍發(fā)生早期，創(chuàng)面炎性反應應激能力下降。

圖3 4組干預治療后第12天創(chuàng)面組織超微結構（×30 000，醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色）Figure 3 Ultrastructure of the wound tissue at the 12th day after intervention

皮膚再生醫(yī)療技術是當代中醫(yī)藥外治燒傷、創(chuàng)傷、潰瘍的重要方法之一，MEBO作為其核心藥物，可以通過祛腐生肌來修復創(chuàng)面，促進愈合［15-16］。本課題組前期研究顯示，MEBO干預后，糖尿病性潰瘍大鼠模型創(chuàng)面組織中AGEs含量及RAGE mRNA表達水平顯著降低，能夠調控NF-κB，并改善創(chuàng)面組織炎性細胞浸潤，促進創(chuàng)面修復愈合［8］。因此，本研究選擇AGEs-RAGE信號通路下游因子ICAM-1、VCAM-1為檢測指標，在前期基礎上，通過制備糖尿病性潰瘍大鼠模型，觀察MEBO的干預治療作用。結果顯示，與模型亞組比較，MEBO亞組大鼠創(chuàng)面損傷第6、12天時，創(chuàng)面組織ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達水平顯著降低，超微結構亦顯示內皮細胞、成纖維細胞內容物豐富，內質網未見明顯擴張，細胞核和線粒體結構亦趨于完整，提示MEBO能通過調控ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達水平，明顯改善創(chuàng)面組織細胞的超微結構，加速細胞器恢復正常，促進糖尿病性潰瘍創(chuàng)面愈合。

綜上所述，MEBO能調控創(chuàng)面組織AGEs-RAGE信號通路下游因子ICAM-1、VCAM-1表達水平，顯著改善糖尿病性潰瘍大鼠創(chuàng)面組織細胞的超微結構，維持細胞內環(huán)境，促進細胞增殖分化，進一步證實MEBO治療糖尿病性潰瘍的藥物作用靶點，可能與AGEs-RAGE信號通路有關，從而為糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的中醫(yī)藥干預治療機制提供了實驗依據。本研究僅對AGEs-RAGE信號通路下游因子ICAM-1、VCAM-1進行了實驗觀察，對信號通路中氧化應激、炎性因子等指標的影響，有待后續(xù)實驗進一步研究明確。

本文意義：

本研究從細胞超微結構及分子基因水平研究濕潤燒傷膏治療糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的修復機制。通過建立糖尿病性潰瘍大鼠模型，觀察濕潤燒傷膏在治療過程中對創(chuàng)面組織細胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子1（VCAM-1）基因表達的影響，以及對組織細胞結構及功能的改變，明確了濕潤燒傷膏治療糖尿病性潰瘍的部分藥物作用機制，為濕潤燒傷膏的臨床應用提供實驗依據和理論依據，為進一步深入探討糖尿病性潰瘍創(chuàng)面愈合的修復機制提供了可能的參考指標。

作者貢獻：王麗、李杰輝進行文章的構思與設計，結果的分析與解釋；王麗、李杰輝、張春霞、狄鉀騏、劉明進行研究的實施與可行性分析；張春霞、狄鉀騏進行數據收集；劉明、劉雪琴進行數據整理；張春霞進行統(tǒng)計學處理；王麗撰寫論文，負責文章的質量控制及審校；李杰輝進行論文的修訂，對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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