顧 超 王 磊 杜月光 柴可夫

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)自發(fā)性2型糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)大鼠空腹血糖（FBG）、血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、總膽固醇（CHOL）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）、24h尿蛋白定量（UP）以及TNF-α（腫瘤壞死因子-α）、TGF-β1（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 1）指標(biāo)變化的影響，并運(yùn)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)其療效進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 藥物：益氣養(yǎng)陰活血方主要組成藥物為生黃芪、靈芝、女貞子、葛根、丹參、制大黃6味中藥，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)濱江中醫(yī)門(mén)診部提供。

1.2 動(dòng)物模型的建立及分組：健康雄性Zucker糖尿病肥胖(zucker diabetic fatty，ZDF)大鼠 40只，體重250±10g，健康雄性ZL大鼠8只，體重180±10g，均購(gòu)自北京維通利華生物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK(京)2002-0003，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)及管理。將40只ZDF大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，改用高脂高糖飼料喂養(yǎng)3周。尾靜脈取血，血糖高于16.7mmo1/L的為模型成功。稱(chēng)重，按隨機(jī)數(shù)字表分為：模型組、中西醫(yī)結(jié)合治療早期干預(yù)組（簡(jiǎn)稱(chēng)早期干預(yù)組）、益氣養(yǎng)陰活血方治療組（簡(jiǎn)稱(chēng)中藥組）、西藥治療組（簡(jiǎn)稱(chēng)西藥組）以及中西醫(yī)結(jié)合治療組（簡(jiǎn)稱(chēng)中西醫(yī)組）。8只ZL大鼠為正常對(duì)照組。以上各組大鼠均分籠飼養(yǎng)，自由飲水及進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)期間除正常對(duì)照組大鼠以普通飼料喂養(yǎng)，其余各組均以高糖高脂飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22±1℃、濕度59%～61%，12h交替照明，大鼠自由飲水，攝食。分組后，各組大鼠進(jìn)行相對(duì)應(yīng)干預(yù)治療：正常對(duì)照組不加以任何處理因素；糖尿病模型組每日灌2ml生理鹽水；中藥組予以益氣養(yǎng)陰活血方灌胃給藥，按體表面積換算，以等效劑量計(jì)算大鼠用藥量，每天灌胃1次；西藥組予以長(zhǎng)效胰島素(魚(yú)精蛋白鋅胰島素)每日皮下注射，15U/kg，使空腹血糖接近正常(6～8mmo1/L)；中西醫(yī)組在益氣養(yǎng)陰活血方灌胃給藥同時(shí)，予以長(zhǎng)效胰島素(魚(yú)精蛋白鋅胰島素)每日皮下注射。早期干預(yù)組處理同中西醫(yī)組，時(shí)間早于其他各組3周進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)期間每周測(cè)量每組實(shí)驗(yàn)大鼠血糖并予以記錄；用代謝籠每周收集各組大鼠尿液進(jìn)行24h尿蛋白定量檢測(cè)并記錄。實(shí)驗(yàn)大鼠從糖尿病腎病的發(fā)生到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，經(jīng)歷了早、中、晚3期的過(guò)程。

1.3 標(biāo)本收集與處理：整個(gè)實(shí)驗(yàn)共連續(xù)進(jìn)行11周，其中早期干預(yù)組為干預(yù)11周，其余各組干預(yù)8周。處死前24h用大鼠代謝籠收集24h尿標(biāo)本，禁食8h后用10%水合氯醛3.5mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，頸椎脫臼處死大鼠。

1.4 生化指標(biāo)檢測(cè)及方法：FBG、Scr、BUN、CHOL、HDL-C、LDL-C、TG用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，UP用放免法測(cè)定；TNF-α、TGF-β1用ELISA檢測(cè)，試劑盒由上海博谷科技有限公司提供，操作按說(shuō)明書(shū)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：選擇SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般情況：正常組大鼠飲食正常，反應(yīng)敏捷，被毛有光澤，肌肉豐滿(mǎn)，身無(wú)傷痕，尾不彎曲，天然孔無(wú)分泌物，糞便成麥粒狀，尿量正常。模型組、早期干預(yù)組、中藥組、西藥組以及中西醫(yī)組適應(yīng)性喂養(yǎng)時(shí)狀態(tài)與正常組大鼠基本相同。高脂高糖飼料喂養(yǎng)3周后，均出現(xiàn)明顯的多飲多食多尿癥狀，并逐漸出現(xiàn)糞便溏瀉，被毛偏枯，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，懶倦少動(dòng)。實(shí)驗(yàn)最后1周，與正常組相比，模型組大鼠體型明顯肥胖，皮下脂肪偏多，肌肉偏少，活動(dòng)減少，被毛干枯無(wú)光澤，灌胃時(shí)幾乎不掙扎，糞便稀溏；各治療組大鼠較對(duì)照組情況均有改善，精神較好，灌胃治療時(shí)偶有掙扎現(xiàn)象，被毛稍有光澤，糞便時(shí)有成型。

2.2 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)DKD大鼠FBG的影響：結(jié)果如表1所示，治療處理前，模型組及各治療組與對(duì)照組比較，F(xiàn)BG均顯著偏高（P＜0.05）。治療處理后，與模型組比較，除中藥組FBG水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其余各組FBG水平均顯著降低（P＜0.05）。

2.3 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)DKD大鼠尿蛋白的影響：結(jié)果如表2所示，治療處理前，模型組與對(duì)照組比較，UP水平顯著偏低（P＜0.05）；各治療組與對(duì)照組比較，UP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療處理后，模型組與對(duì)照組比較，UP水平顯著上升（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組UP水平顯著上升（P＜0.05）。

表1 各組大鼠空腹血糖變化（-x±s，mmol/L）

表2 各組大鼠尿蛋白含量變化（-x±s，mg/L）

2.4 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)DKD大鼠TG、CHOL、HDL-C、LDLC的影響：結(jié)果如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組TG、CHOL、HDL-C、LDL-C水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，各治療組TG水平顯著升高（P＜0.05）；各治療組CHOL、LDL-C水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；除中藥組HDL-C水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其余各組HDL-C水平均顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血脂變化（-x±s，mmol/L）

2.5 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)DKD大鼠腎功能的影響：結(jié)果如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組BUN、Scr水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，除西藥組BUN水平顯著降低（P＜0.05）外，其余各組BUN水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；除中藥組Scr水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其余各個(gè)治療組Scr水平均顯著降低（P＜0.05）。

表4 各組大鼠腎功能變化（-x±s，mmol/L）

2.6 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)DKD大鼠TNF-α、TGF-β1的影響：結(jié)果如表5所示，與對(duì)照組比較，模型組TNF-α、TGF-β1水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組TNF-α、TGF-β1水平顯著升高（P＜0.05），其余治療組TNF-α、TGF-β1顯著降低（P＜0.05）。

表5 各組大鼠TNF-α、TGF-β1水平變化（-x±s，pg/ml）

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病最常見(jiàn)且難治的慢性微血管并發(fā)癥，是糖尿病患者死亡的主要原因之一。發(fā)病之初以微量白蛋白尿?yàn)橹?，隨著病情的進(jìn)展，終將導(dǎo)致大量蛋白尿、腎功能衰竭、尿毒癥[1]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)并無(wú)糖尿病腎病的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)及病情發(fā)展，現(xiàn)代醫(yī)家將其歸屬于“消渴”“水腫”“尿濁”“關(guān)格”等范疇。多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為，糖尿病腎病最基本的病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，虛、痰、瘀貫穿本病的始終，總屬于本虛標(biāo)實(shí)之證，主要與稟賦不足、情志不遂、素體陰虛、勞欲過(guò)度等有著密切的關(guān)系。目前，眾多學(xué)者認(rèn)為DKD的病位在腎，腎元受損、脈絡(luò)瘀阻貫穿始終，即認(rèn)為腎虛血瘀是DKD的主要病機(jī)[2]。DKD患者由于長(zhǎng)期處于高糖高滲利尿狀態(tài)，血液濃縮，血流緩慢，血液黏稠度增加，加之代謝紊亂，存在高脂血癥，使血液流變學(xué)異常，微循環(huán)障礙，血液呈濃、凝、黏聚狀態(tài)，符合中醫(yī)學(xué)中“瘀血”的臨床特征；而DKD的重要病理變化即不同程度的腎小球、腎小管硬化、腎間質(zhì)纖維化，此亦屬中醫(yī)學(xué)中“瘀血”范疇[2]。因此，治療當(dāng)以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀通絡(luò)為法。

益氣養(yǎng)陰活血方主要由黃芪、女貞子、葛根、丹參、制大黃組成。黃芪補(bǔ)中益氣；女貞子擅補(bǔ)肝腎之陰；葛根生津，又能升發(fā)清陽(yáng)。三藥合用，益氣養(yǎng)陰，補(bǔ)而不滯。丹參涼血祛瘀；制大黃活血化瘀，推陳出新。兩者均清熱涼血，以除燥熱之標(biāo)。全方針對(duì)糖尿病氣陰兩虛之本以及逐漸加重的瘀血之標(biāo)，標(biāo)本兼治，攻補(bǔ)兼施。采用Zucker糖尿病肥胖大鼠模型，能夠更好地模擬人類(lèi)2型糖尿病腎病疾病的特征和病程進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在DKD發(fā)生時(shí)存在糖脂代謝異常、腎功能損傷、TGF-β1和TNF-α異常，且后二者之間及與糖脂代謝水平、腎臟損傷密切相關(guān)。兩者共同參與引起了糖脂代謝失常及早期腎臟損傷，且加劇并最終導(dǎo)致DKD的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)顯示，益氣養(yǎng)陰活血方、胰島素可在不同程度上改善DKD大鼠的血糖血脂、BUN、Scr以及TNF-α、TGF-β1水平，其中以中西醫(yī)組和早期干預(yù)組在其中多個(gè)項(xiàng)目水平統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯，說(shuō)明益氣養(yǎng)陰活血方可以改善DKD大鼠糖脂代謝水平且對(duì)腎纖維化的發(fā)展具有一定的延緩作用。其機(jī)制可能為服用益氣養(yǎng)陰活血方后TNF-α、TGF-β1下降，減少了高毒性自由基的形成，阻礙了脂質(zhì)的過(guò)氧化及細(xì)胞損傷，血脂水平下降；阻礙TGF-β1/Smad通路，減少腎系膜細(xì)胞、腎小管上皮等間質(zhì)細(xì)胞中Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白及層黏連蛋白等合成，從而延緩腎纖維化的進(jìn)程。綜上所述，益氣養(yǎng)陰活血方具有一定的改善TNF-α、TGF-β1水平進(jìn)而改善糖脂代謝的功效；改善TNF-α、TGF-β1水平，進(jìn)而調(diào)整糖脂代謝水平，有可能成為治療DKD、改善腎功能、延緩腎纖維化的新途徑。

[1]張曉明,賈素慶.益氣固本湯為主治療糖尿病腎病63例[J].浙江中醫(yī)雜志,2016,51(8)：582.

[2]呂仁和,趙進(jìn)喜.糖尿病及其并發(fā)癥中西醫(yī)診治學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：261,590-616.

[3]傅珍春,徐剛,黃妙珍.三七總苷對(duì)不同階段糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].浙江中醫(yī)雜志,2016,51(5)：335-337.