陳　晨, 李墨非， 孫 黎

(1.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

CD80為抗原遞呈細(xì)胞上一種膜糖蛋白，隸屬于免疫球蛋白超家族[1-2]。在免疫系統(tǒng)中，抗原遞呈細(xì)胞表面的CD80分子和免疫球蛋白超家族中的另一成員CD86與T淋巴細(xì)胞表面的配體CD28結(jié)合，從而協(xié)同刺激T細(xì)胞增殖、活化[3]，在機(jī)體清除病原體以及體液免疫與細(xì)胞免疫過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)于CD80的功能研究主要集中在哺乳動(dòng)物中和少數(shù)鳥類中[3]。在人類的抗原遞呈過程中，CD80通過與輔助T細(xì)胞前體細(xì)胞(Thp)表面的CD28分子結(jié)合，使Thp分化形成輔助T細(xì)胞(Th)細(xì)胞，Th細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子增強(qiáng)免疫效應(yīng)并激活下一步免疫反應(yīng)[4]。目前在魚類中關(guān)于CD80的報(bào)道較少，Zhang等對(duì)虹鱒魚的CD80/86分子進(jìn)行了克隆鑒定及功能分析，發(fā)現(xiàn)CD80/86基因在大腸桿菌脂多糖和弧菌毒素刺激下表達(dá)顯著上調(diào)，且CD80/86能調(diào)節(jié)IL-2基因的表達(dá)，說明CD80/86在抵抗細(xì)菌侵染、調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)中起重要作用[3]。Shao等發(fā)現(xiàn)斑馬魚樹突細(xì)胞上存在CD80/86，并具有與哺乳動(dòng)物中的CD80相似功能[1]。湯菊芬等對(duì)尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus) CD80分子進(jìn)行了克隆鑒定，并分析了健康狀態(tài)及細(xì)菌感染后CD80在羅非魚不同組織中的基因表達(dá)情況[5]。但是，在我國(guó)經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類半滑舌鰨中，CD80尚未有研究。

半滑舌鰨是中國(guó)珍貴的海水養(yǎng)殖魚類，因味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富深受廣大消費(fèi)者的喜愛，具有很大的市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，由細(xì)菌、病毒引起的疾病給半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)和細(xì)胞腫大病毒是引起半滑舌鰨細(xì)菌性疾病的主要病原微生物[6-7]。本研究從半滑舌鰨基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中克隆得到CD80的基因(命名為CsCD80)，檢測(cè)了CsCD80在健康半滑舌鰨和病原感染的半滑舌鰨不同組織中的表達(dá)情況，并且檢測(cè)了重組表達(dá)的CsCD80蛋白與半滑舌鰨外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的結(jié)合能力。

1　材料和方法

1.1　材料

半滑舌鰨購(gòu)于山東青島商業(yè)化養(yǎng)殖場(chǎng)，暫養(yǎng)于20℃通氣海水中2周。哈維氏弧菌(V.harveyi)[8]、細(xì)胞腫大病毒RBIV-C1[9]由實(shí)驗(yàn)室分離保存。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光實(shí)時(shí)定量試劑盒(SYBR EXScript qRT-PCR Kit)等購(gòu)自TaKaRa生物有限公司； RNA提取試劑盒(EZNA Total RNA Kit)、凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo公司，Leibovitz′s L15培養(yǎng)液購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，小鼠抗His抗體， FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自康為試劑公司。蛋白表達(dá)載體pET32a 購(gòu)自Novagen公司。序列測(cè)序及引物合成由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。

1.2　方法

1.2.1 CsCD80 基因序列獲得及序列分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中半滑舌鰨的全基因組中獲得CsCD80的基因序列，信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)采用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)，多重序列比對(duì)使用DNAMAN，比對(duì)結(jié)果以序列相似度(sequence identity)形式表示。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CsCD80在不同組織中的表達(dá)量

為檢測(cè)正常生理狀況下CsCD80在不同組織中的表達(dá)量，將健康半滑舌鰨隨機(jī)分組，每組5條，麻醉后取心臟、血、肝、脾、頭腎、鰓、肌肉、腦和腸組織，按照EZNA Total RNA Kit說明提取總RNA，用Nanodrop測(cè)定其純度，通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性。并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以該cDNA 為模板，β-actin 基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR。根據(jù) β-actin 基因和CsCD80 基因序列分別設(shè)計(jì)引物為：β-actin-F(5′-GCACGGTATTGTGACCAACTGG-3′)、β-actin-R(5′-CAGGGGAGCCTCTGTGAGC-3′)、CsCD80-RT-F(5′-CCAGAAACCAAGATGAGGATGA-3′)、CsCD80-RT-R(5′-TGAAGACAGCGGTGGAGGA-3′)。反應(yīng)體系為20 μL， 包括SYBR Premix ExTaq10 μL，CsCD80-RT-F(β-actin-F) 0.2 μL，CsCD80-RT-R(β-actin-R) 0.2 μL，ddH2O 7.6 μL，cDNA模板2 μL。在Eppendorf Mastercycle實(shí)時(shí)定量 PCR 儀上進(jìn)行， 反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃預(yù)變性30 s；95℃退火5 s，59℃退火30 s， 72℃延伸10 s， 40個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCT法計(jì)算CsCD80表達(dá)量[10]， 并使用 Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

為檢測(cè)在哈維氏弧菌(V.harveyi)刺激下CsCD80表達(dá)量的變化，使用LB培養(yǎng)基將V.harveyi培養(yǎng)至OD600=0.8，用PBS緩沖液洗3次并重懸至2×106CFU/mL，制成細(xì)菌懸液備用。將健康半滑舌鰨隨機(jī)分成2組，每組20條，實(shí)驗(yàn)組每條注射50 μL細(xì)菌注射液，對(duì)照組每條注射50 μL PBS，均采用腹腔注射。感染6、12、24和48 h后取樣，每個(gè)處理每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取5條魚，收集肝、脾和頭腎組織。分別以18S rRNA、ribosomal protein L18(RPL18)和β-actin作為內(nèi)參基因，按照上述方法檢測(cè)細(xì)菌刺激后半滑舌鰨肝、脾、頭腎組織中的CsCD80表達(dá)量變化。

圖1 CsCD80相似序列比對(duì)Fig 1 Alignment of the sequences of CsCD80 homologues括號(hào)內(nèi)為CsCD80與比較序列的相似度。保守氨基酸殘基用黑色陰影標(biāo)出，相似度>75%的氨基酸殘基用紅色陰影標(biāo)出，相似度>50%的氨基酸殘基用藍(lán)色陰影標(biāo)出。

為檢測(cè)在細(xì)胞腫大病毒RBIV-C1刺激下CsCD80表達(dá)量的變化，用PBS緩沖液將RBIV-C1病毒組織液稀釋到5×105拷貝/mL制成病毒注射液備用。將健康半滑舌鰨隨機(jī)分成2組，每組20條，實(shí)驗(yàn)組每條注射50 μL病毒注射液。對(duì)照組每條腹腔注射50 μL PBS，均采用腹腔注射。侵染后1、3、5和7 d時(shí)取樣，每個(gè)處理組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取5條魚，收集肝、脾和頭腎組織。以β-actin作為內(nèi)參基因，按照上述方法檢測(cè)病毒刺激后半滑舌鰨肝、脾和頭腎組織中的CsCD80表達(dá)量變化。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3重組CsCD80蛋白(rCsCD80)和重組Trx蛋白(rTrx)的表達(dá)和純化

重組蛋白表達(dá)使用蛋白表達(dá)載體pET32a。首先構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pETCsCD80，設(shè)計(jì)特異性引物CsCD80-F(5′-CCCGGGATGGGAGGTCTCCTGCA-3′ ，加下劃線的序列為SmaI酶切位點(diǎn))、CsCD80-R(5′-CCCGGGAGTATTTGGCCAGTCGGG-3′，加下劃線的序列為SmaI酶切位點(diǎn))擴(kuò)增CsCD80的胞外段(34～241位氨基酸)，PCR產(chǎn)物克隆至T-A的克隆載體pEASY-T1后，提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒用SmaI內(nèi)切酶消化后，切膠回收酶切目的片段，將回收的酶切目的片段插入表達(dá)質(zhì)粒pET32a。經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑選單克隆、菌落PCR和測(cè)序確認(rèn)后，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD600=0.5，加入0.4 mmol/L IPTG后，于16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h，收集菌液，經(jīng)液氮速凍、超聲破碎后，使用Ni-NTA瓊脂糖柱純化蛋白質(zhì)，將純化后的重組CsCD80蛋白(rCsCD80)裝入透析袋中進(jìn)行復(fù)性[11]。同時(shí)，使用pET32a表達(dá)重組標(biāo)簽蛋白rTrx，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照蛋白。蛋白濃度使用Nanodrop測(cè)定。

1.2.4rCsCD80與半滑舌鰨外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的相互作用

用Percoll密度梯度離心法[12]提取健康半滑舌鰨(750±10)g的外周血淋巴細(xì)胞，在L15培養(yǎng)液中稀釋至1×108細(xì)胞/mL，將rCsCD80、rTrx加入PBL懸液中，使其終濃度為80 μmol/L，28℃孵育2 h后，PBS洗3次，加入稀釋1000倍的小鼠抗His抗體，37℃孵育1 h后，PBS洗3次，加入稀釋1000倍的FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，37℃避光孵育1 h后，PBS洗3次，滴加至載玻片上，蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2　結(jié)果

2.1　CsCD80序列分析

CsCD80基因序列開放閱讀框含有882個(gè)堿基，共編碼293個(gè)氨基酸，其理論分子質(zhì)量為32.45 ku，理論等電點(diǎn)pI=7.97，N-末端1～31位氨基酸殘基為信號(hào)肽序列，37～129位氨基酸殘基為免疫球蛋白V區(qū)(IgV)結(jié)構(gòu)域，是免疫球蛋白超家族的保守特征，233～267位氨基酸為α螺旋的跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域。氨基酸組成中絲氨酸(Ser)含量最高，占11.26%。選取與CsCD80序列相似度最高的前7個(gè)物種進(jìn)行多重序列比對(duì)(這7個(gè)物種按相似度從高到低，其GenBank登錄號(hào)依次為：XP_019950451.1、XP_019903483.1、XP_014070714.1、ACH58053.1、XP_017346141.1、XP_018918527.1、XP_017206576.1)。結(jié)果表明，CsCD80與牙鲆(Paralichthysolivaceus)CD80相似性最高，為41.37%，與其他魚類的CD80相似性較低(19.01%～41.37%)，見圖1。

2.2　CsCD80在半滑舌鰨不同組織中的表達(dá)

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CsCD80在健康半滑舌鰨的不同組織中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CsCD80在檢測(cè)的9種組織中均有表達(dá)，其中在肝中表達(dá)量最高，其次為脾、心、腦、鰓、肌肉、腎、腸和血，肝中的表達(dá)量為血中的表達(dá)量的508.2倍(圖2)。

2.3 哈維氏弧菌、細(xì)胞腫大病毒感染后半滑舌鰨中CsCD80的表達(dá)

在V.harveyi感染半滑舌鰨6、12、24和48 h后，通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CsCD80在肝、脾、頭腎中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝中CsCD80在感染后6、12、24和48 h表達(dá)量均有顯著上調(diào)，脾中CsCD80在感染后6 h表達(dá)量顯著上調(diào)，頭腎中CsCD80在感染后6、12和24 h表達(dá)量均有顯著上調(diào)，在肝、脾、頭腎中CsCD80的最大表達(dá)量分別出現(xiàn)在感染后的24、6和24 h，表達(dá)量為對(duì)照組的66.7倍、14.3倍和3.3倍(圖3-A～C)。在病毒RBIV-C1感染半滑舌鰨的1、3、5和7 d后，通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CsCD80在肝、脾、頭腎中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝中CsCD80在感染后3、5和7 d表達(dá)量均有顯著上調(diào)，脾中CsCD80在感染后1 d和3 d表達(dá)量均有顯著上調(diào)，頭腎中CsCD80在感染后1、3、5和7 d表達(dá)量均有顯著上調(diào)，在肝、脾和頭腎中CsCD80的最大表達(dá)量分別出現(xiàn)在感染后的3 d、3 d和7 d，表達(dá)量為對(duì)照組的9.6倍、12.3倍和6.2倍(圖3-D～F)。

圖2 CsCD80在健康的半滑舌鰨組織中的表達(dá)情況

為方便比較，將血中的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1；數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示

圖3 細(xì)菌、病毒感染后CsCD80在半滑舌鰨組織中的表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)組半滑舌鰨感染哈維氏弧菌(A～C)和細(xì)胞腫大病毒(D～F)；對(duì)照組半滑舌鰨未感染細(xì)菌和病毒，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)CsCD80在肝、脾、腎中的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1，數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。*P< 0.05；**P< 0.01

2.4　rCsCD80與半滑舌鰨外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的結(jié)合

通過原核表達(dá)的方法獲得rCsCD80和rTrx(圖4)。rCsCD80和rTrx與半滑舌鰨的PBL孵育后，用帶有綠色熒光的抗體檢測(cè)與細(xì)胞結(jié)合的重組蛋白。結(jié)果表明，rCsCD80與PBL孵育后，在熒光顯微鏡下觀察到PBL表面有綠色熒光，而rTrx與半滑舌鰨PBL孵育后，在PBL表面未觀察到綠色熒光(圖5)。該結(jié)果說明rCsCD80能夠與PBL結(jié)合。

圖4 rCsCD80和 rTrx的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig 4 SDS-PAGE analysis of rCsCD80 and rTrx

泳道1：蛋白Marker；泳道2：重組表達(dá)的CsCD80蛋白；泳道3：重組Trx蛋白

圖5 rCsCD80與半滑舌鰨外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的結(jié)合Fig 5 Binding of rCsCD80 to the peripheral blood lymphocytes(PBL) of C. semilaevis

半滑舌鰨PBL先與rCsCD80(A-C)或rTrx(D-F)孵育后，再與抗His-tag抗體孵育，隨后與FITC標(biāo)記的二抗孵育，在熒光顯微鏡下觀察。C為A、B融合后的圖；F為D、E融合后的圖

3　討論

本研究從半滑舌鰨全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中克隆得到了CsCD80序列。序列分析表明，CsCD80與牙鲆CD80同源性最高。氨基酸序列分析表明，CsCD80包含兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即免疫球蛋白V區(qū)結(jié)構(gòu)域和α螺旋結(jié)構(gòu)跨膜結(jié)構(gòu)域，而在虹鱒魚中，CD80不僅包含這兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，還包含一個(gè)免疫球蛋白C區(qū)(IgC)結(jié)構(gòu)域[3]。這些結(jié)果說明在不同魚類中CD80存在序列和結(jié)構(gòu)上的差異。

組織特異性表達(dá)分析表明，在健康狀態(tài)的半滑舌鰨中，CsCD80在9種組織中有不同程度的表達(dá)，其中在肝和脾中的表達(dá)量較高，該結(jié)果與已報(bào)道的尼羅羅非魚組織表達(dá)情況較相似[5]，而在虹鱒魚中，CD80在血中表達(dá)量最高，脾中表達(dá)量次之[3]。這可能是由于虹鱒和半滑舌鰨免疫機(jī)制存在差別有關(guān)。在人類CD80研究中， CD80分子存在于肝細(xì)胞表面，且在丙型肝炎病毒刺激下，CD80在肝細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)，說明在人體中CD80可能發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞的作用[13]。此外，肝是補(bǔ)體合成的主要器官，因此推測(cè)半滑舌鰨中CsCD80在肝中表達(dá)量最高可能是一種自身保護(hù)機(jī)制，保護(hù)細(xì)胞免受由補(bǔ)體引起的損傷。脾臟是魚類重要的免疫器官，是魚類機(jī)體中中性粒細(xì)胞、 紅細(xì)胞等產(chǎn)生、 儲(chǔ)存和成熟的主要場(chǎng)所，具有產(chǎn)生各種免疫細(xì)胞的功能，在魚類特異性免疫過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。在本研究中，CsCD80在半滑舌鰨脾臟中有大量表達(dá)，可能說明CsCD80在脾臟中參與半滑舌鰨的免疫進(jìn)程。

在虹鱒CD80研究中發(fā)現(xiàn)，用大腸桿菌脂多糖和弧菌毒素對(duì)虹鱒進(jìn)行免疫刺激后，CD80表達(dá)量顯著上調(diào)[3]。在尼羅羅非魚中，用滅活無乳鏈球菌對(duì)其進(jìn)行免疫刺激后，CD80在羅非魚的腸、鰓、腦、脾、腎、胸腺中表達(dá)量均顯著上調(diào)[5]。在本研究中也存在類似現(xiàn)象，V.harveyi和細(xì)胞腫大病毒是半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)中的常見病原微生物[6-7]，在V.harveyi和細(xì)胞腫大病毒感染半滑舌鰨后，CsCD80在肝、脾、頭腎中的表達(dá)量均呈現(xiàn)顯著上調(diào)，且呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性表達(dá)模式。這些結(jié)果表明CsCD80可能在半滑舌鰨抵抗V.harveyi和細(xì)胞腫大病毒侵染的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。

在人類CD80研究中發(fā)現(xiàn)，CD80能刺激PBL使其增殖，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)[16]。在本研究中，rCsCD80與半滑舌鰨PBL孵育后，通過免疫熒光檢測(cè)，可觀察到半滑舌鰨PBL表面出現(xiàn)綠色熒光，說明rCsCD80能結(jié)合到PBL表面，由此推測(cè)半滑舌鰨PBL表面可能存在rCsCD80的配體，rCsCD80通過與PBL表面配體結(jié)合，可能會(huì)進(jìn)一步刺激PBL增殖從而加強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)強(qiáng)度。

4　結(jié)論

本研究克隆了半滑舌鰨CsCD80的DNA序列，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與牙鲆CD80序列相似度最高。在健康狀態(tài)的半滑舌鰨中，CsCD80在肝和脾中具有高表達(dá)量，在細(xì)菌和病毒感染后，CsCD80 在肝、脾、頭腎中表達(dá)量均有顯著上調(diào)，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴模式，揭示CsCD80可能在半滑舌鰨的抗感染免疫應(yīng)答過程中起重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)rCsCD80能夠結(jié)合到PBL表面，暗示rCsCD80可能通過與PBL上的配體結(jié)合而引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。本研究結(jié)果為深入研究半滑舌鰨CD80的免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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