陳志龍， 吳曉敏， 鄭 琛， 許曉玲， 白佳樺， 劉 彥， 馮 濤

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 蘭州 730070； 2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所， 北京 100097)

繁殖活動是動物生產(chǎn)系統(tǒng)中的重要活動，初情期的啟動則是動物繁殖活動的開始。而初情期的啟動則依賴于神經(jīng)內(nèi)分泌生殖軸下丘腦-垂體-性腺軸的活化[1]。下丘腦GnRH神經(jīng)元分泌的促性腺激素釋放激素GnRH能夠刺激垂體腺分泌促卵泡素FSH、促黃體素LH以及催乳素PRL，進(jìn)而促進(jìn)性腺的發(fā)育與成熟并分泌雌激素(estrogen，E2)以維持性腺機(jī)能以及發(fā)情表現(xiàn)。當(dāng)體組織發(fā)育不完全時，雌激素與其受體結(jié)合調(diào)控下丘腦弓狀核區(qū)域的Kisspeptin神經(jīng)元對GnRH神經(jīng)元產(chǎn)生負(fù)反饋效應(yīng)，抑制性腺發(fā)育；而當(dāng)體組織發(fā)育成熟時，雌激素通過調(diào)控下丘腦前腹側(cè)室旁核Kisspeptin神經(jīng)元對GnRH神經(jīng)元產(chǎn)生正反饋，促進(jìn)性腺發(fā)育及發(fā)情表現(xiàn)[2]。因而，雌激素對下丘腦GnRH神經(jīng)元的正負(fù)反饋調(diào)控，是確保動物正常性發(fā)育和啟動初情期的關(guān)鍵。研究雌激素及其受體對GnRH分泌的調(diào)控機(jī)理是深入揭示動物初情期啟動機(jī)理的關(guān)鍵組成部分。然而GnRH神經(jīng)元在動物腦內(nèi)不超過3000個，彌散的分布于前腦，體內(nèi)研究較為困難。

近年來，利用小鼠永生GT1-7細(xì)胞系體外研究GnRH神經(jīng)元的脈沖分泌及相關(guān)基因表達(dá)的研究較多。GT1-7細(xì)胞系可作為GnRH神經(jīng)元的離體模型，其無論表型形態(tài)，激素分泌方式、相關(guān)基因及蛋白表達(dá)均與GnRH神經(jīng)元一致，且能在體外無限分裂傳代，遺傳信息穩(wěn)定，因而被認(rèn)為是下丘腦GnRH神經(jīng)元的體外理想細(xì)胞模型[3]。前人的研究表明，低濃度pM級雌激素能夠促進(jìn)GnRH的分泌，因此本實(shí)驗(yàn)利用高濃度1 μmol/L雌激素對GT1-7細(xì)胞處理不同時間研究高濃度雌激素對GnRH分泌及GnRH相關(guān)基因(GnRH、KISS-1、ERα和GPR54 mRNA)表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究GnRH合成和分泌的調(diào)控提供依據(jù)。

1　材料

1.1　儀器及材料

本實(shí)驗(yàn)所用GT1-7細(xì)胞為美國加州大學(xué)Mellon教授惠贈，主要儀器包括常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)等。主要試劑包括DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素混合液(Gbico公司)、17β-雌二醇(Sigma公司)、細(xì)胞培養(yǎng)上清GnRH檢測試劑盒(TSZ公司)，以及細(xì)胞總RNA提取試劑盒、第一鏈合成試劑盒、快速熒光定量檢測試劑盒(天根公司)等。

2　方法

2.1　GT1-7細(xì)胞培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)主要材料為GT1-7細(xì)胞系，獲得后對其進(jìn)行復(fù)蘇及細(xì)胞傳代以擴(kuò)大培養(yǎng)，滿足實(shí)驗(yàn)所需的所有細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定傳代后將處于對數(shù)增長期的細(xì)胞進(jìn)行凍存以避免污染，穩(wěn)定傳代。

將GT1-7細(xì)胞從液氮取出后，37℃水浴復(fù)蘇于含有10%胎牛血清(FBS)、1%青/鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液中，然后900 r/min離心4 min，在超凈工作臺中使用新鮮的完全培養(yǎng)液重懸后接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)于恒溫37℃、飽和濕度、5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中，每隔24 h更換新的培養(yǎng)液。待GT1-7細(xì)胞長滿至培養(yǎng)瓶底面的80%～90%時，使用0.25%的胰酶(Try-EDTA)消化，待細(xì)胞開始從培養(yǎng)瓶壁上掉落時使用含有血清的完全培養(yǎng)液終止消化，900 r/min離心4 min，重懸后接入新的培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代。培養(yǎng)3代以上細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定時可用于實(shí)驗(yàn)研究，本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞在3～15代之間。

2.2　雌激素處理GT1-7細(xì)胞

GT1-7細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底面匯合至80%～90%時可消化重懸后用于實(shí)驗(yàn)。將得到的GT1-7細(xì)胞懸液使用細(xì)胞計數(shù)儀測其密度，根據(jù)濃度稀釋至2×105個/mL的濃度均勻接種至12孔板中，每孔2 mL，每個處理3個重復(fù)，培養(yǎng)于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱。待細(xì)胞匯合至80%～90%時，取出至無菌工作臺，輕輕吸去培養(yǎng)液，各孔用1 mL PBS洗滌2遍以去除血清對實(shí)驗(yàn)的干擾，然后每孔接入2 mL無血清DMEM配制的1 μmol/L雌激素溶液，重新置于二氧化碳培養(yǎng)箱并計時。

GT1-7細(xì)胞培養(yǎng)至特定的處理時間(0、6、12、18、24和30 h)便從培養(yǎng)箱中取出，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液并收集細(xì)胞。培養(yǎng)液用無菌Ep管收集，2000 r/min離心20 min，取上清液測定GnRH濃度。細(xì)胞沉淀的收集使用胰蛋白酶處理法，吸除多余培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液PBS洗滌細(xì)胞2次，然后向細(xì)胞中加入200 μL 0.25%胰酶消化至脫離容器壁時，使用含有血清的完全培養(yǎng)液終止消化，吹打混勻后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至RNase-Free Ep管中，300 r/min離心5 min后加入細(xì)胞裂解液裂解，震蕩混勻后立即提取RNA或于-80℃冰箱待測。

2.3　細(xì)胞總RNA提取

GT1-7細(xì)胞總RNA的提取使用天根生化科技有限公司離心柱型“RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒”，按照使用說明在室溫下操作，將提取的RNA液收集于RNase-Free離心管，使用分光光度計測RNA濃度和純度后，立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或于-80℃冰柜保存。

2.4　逆轉(zhuǎn)錄為cDNA

本次實(shí)驗(yàn)采取“TIANGEN Quantscript RT Kit Quant cDNA第一鏈合成試劑盒”進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄的體系及RNA濃度計算體系中各成分的添加體積。反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過程在冰上進(jìn)行，然后使用PCR儀37℃孵育60 min。得到cDNA產(chǎn)物，可于-20℃儲存。反轉(zhuǎn)錄體系為：Super pure dNTPs、10×RT Mix、Oligo-(dT)15和Quant Reverse Transcriptase分別為2.0、2.0、2.0、1.0 μL，然后根據(jù)RNA的濃度計算其添加量并使用ddH2O補(bǔ)足至總體積20 μL。

2.5　Real-time PCR

采用FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)快速熒光定量PCR預(yù)混試劑盒進(jìn)行相對熒光定量檢測基因表達(dá)，選擇PRL19作為內(nèi)參基因，引物序列參考已發(fā)表文獻(xiàn)(表1)。

表1 Real-time PCR引物序列

PCR反應(yīng)體系為：2×FastFire qPCR PreMix 10.0 μL、Primer各0.5 μL、cDNA 1.0 μL、ddH2O 8.0 μL，反應(yīng)總體積為20.0 μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1 min；95℃變性5 s，退火10 s(退火溫度見表1),72℃延伸15 s,總計40個循環(huán)數(shù)。

使用熒光定量軟件Bio-Rad CFX Manager 3.1讀取熒光信號記錄Ct值。

2.6　激素測定

實(shí)驗(yàn)使用美國TSZ公司生產(chǎn)的小鼠GnRH酶聯(lián)免疫標(biāo)記檢測試劑盒檢測GT1-7細(xì)胞GnRH的分泌。使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作GnRH標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后利用酶標(biāo)儀根據(jù)樣品在420 nm處的吸光值，計算樣品GnRH濃度。具體操作按照試劑盒使用說明進(jìn)行。

2.7　數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

基因表達(dá)根據(jù)熒光定量軟件自動讀取的Ct值即熒光信號到達(dá)閾值的循環(huán)數(shù)，采用2-△△Ct法計算對照組與實(shí)驗(yàn)組的相對基因表達(dá)[4]。△Ct值為目的基因Ct值減去內(nèi)參基因Ct值，實(shí)驗(yàn)組Ct值減去對照組Ct值得到△△Ct。使對照組目的基因表達(dá)量為2-△△CT=1，目的基因在模板中的相對表達(dá)量為2-△△CT，則2-△△CT值大于1表示促進(jìn)目的基因表達(dá)，反之則抑制目的基因表達(dá)。

3　結(jié)果與分析

3.1　雌激素處理不同時間對GT1-7細(xì)胞GnRH分泌的影響

1 μmol/L的雌激素處理GT1-7細(xì)胞0、6、12、18、24及30 h對GT1-7細(xì)胞GnRH分泌的影響結(jié)果見圖1。

圖1 1 μmol/L雌激素不同時間點(diǎn)處理GT1-7對GnRH分泌的影響

如圖1所示，與對照組相比，1 μmol/L雌激素處理組GnRH分泌量在開始培養(yǎng)的6 h和12 h有所升高(P>0.05)，在培養(yǎng)18 h和30 h則極顯著降低(P<0.01)。

3.2　PCR產(chǎn)物電泳分析

將樣品提取RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA分別以PRL19、GnRH、ERα、KISS-1和GPR54為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其大小依次為185、247、235、154和204 bp(圖2)，得到的產(chǎn)物大小與預(yù)期相符。

圖2 PRL19、GnRH、ERα、KISS-1及GPR54的PCR產(chǎn)物電泳圖

1～5依次表示PRL19、GnRH、ERα、KISS-1和GPR54基因產(chǎn)物的電泳條帶

圖3 1 μmol/L E2處理不同時間對GT1-7細(xì)胞GnRH、ERα、KISS-1、GPR54基因表達(dá)的影響

3.3　雌激素處理不同時間對GT1-7細(xì)胞GnRH分泌相關(guān)基因表達(dá)的影響

1 μmol/L的雌激素處理GT1-7細(xì)胞0、6、12、18、24及30 h，GT1-7細(xì)胞GnRH分泌相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果如圖3。與對照組相比，在整個培養(yǎng)過程中1 μmol/L E2處理組各基因表達(dá)呈降低趨勢。GnRHmRNA表達(dá)除0 h外其他各培養(yǎng)階段較對照組顯著降低(P<0.01)；處理組KISS-1 mRNA表達(dá)較對照組極在各時間點(diǎn)都有降低趨勢，且在培養(yǎng)12 h時極顯著降低(P<0.01)；培養(yǎng)12 h和18 h，E2處理組ERαmRNA表達(dá)較對照組極顯著降低(P<0.01)；GPR54 mRNA表達(dá)較對照組在培養(yǎng)6、12和24 h極顯著降低(P<0.01)。

4　討論

4.1　雌激素處理對GT1-7細(xì)胞GnRH分泌的影響

動物的繁殖活動是中樞神經(jīng)系統(tǒng)綜合內(nèi)源及外源的刺激信號，調(diào)控下丘腦-垂體-性腺軸各水平相關(guān)激素合成釋放，在維持內(nèi)分泌系統(tǒng)穩(wěn)定基礎(chǔ)上適時啟動發(fā)情等一系列內(nèi)分泌活動導(dǎo)致的結(jié)果。促性腺激素釋放激素GnRH的脈沖式分泌是激活動物初情期[5]、保證動物繁殖行為及性腺活動、動物由生長轉(zhuǎn)為繁殖的關(guān)鍵。目前，關(guān)于動物初情期的啟動理論主要有雌激素反饋理論[2,6-7]，即在雌性動物中，雌激素及其受體通過直接或間接作用于下丘腦GnRH神經(jīng)元調(diào)控GnRH合成釋放，進(jìn)而調(diào)控整個生殖系統(tǒng)[8-9]。GT1-7細(xì)胞能夠表現(xiàn)原始GnRH神經(jīng)元的形態(tài)，表達(dá)GnRH、KISS-1及GPR54等基因，以及能夠脈沖式釋放GnRH等功能[10]，廣泛應(yīng)用于體外研究GnRH神經(jīng)元。截至目前，在NCBI的PubMed數(shù)據(jù)庫利用GT1-7細(xì)胞模型研究發(fā)表的論文有400余篇。研究表明，GT1-7細(xì)胞中外源添加雌激素(100 pmol/L)處理72 h，雌激素能夠促進(jìn)GnRH的節(jié)律性分泌[11]。Terasaka等[12]在研究中用100 nmol/L雌激素處理GT1-7細(xì)胞，在培養(yǎng)24 h和48 h(P<0.01)時GnRH分泌呈現(xiàn)不同程度的抑制。Otani等[13]則使用nmol/L級不同濃度(1、10以及100 nmol/L)處理GT1-7細(xì)胞24 h發(fā)現(xiàn)，100 nmol/L雌激素處理顯著降低GT1-7細(xì)胞GnRH分泌和GnRH 基因表達(dá)(P<0.05)，1和10 nmol/L也有抑制GnRH分泌的趨勢(P>0.05)?？梢姶萍に貙nRH分泌的影響會根據(jù)處理濃度呈現(xiàn)出不同規(guī)律且nmol/L級抑制GnRH分泌而pmol/L級促進(jìn)GnRH釋放。Navarro等[14]將GT1-7暴露在pmol/L級的雌激素條件下5～60 min，表現(xiàn)出劑量依賴性抑制cAMP分泌，而nmol/L級處理60 min可促進(jìn)cAMP分泌。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件下研究發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L的雌激素處理GT1-7細(xì)胞能夠抑制GnRH釋放，雌激素在處理6 h和12 h時GnRH有一定程度的升高(P>0.05)，在12 h后的GnRH分泌表現(xiàn)出抑制效果，尤其在18 h和30 h達(dá)到極顯著的抑制效果(P<0.01)，可能與培養(yǎng)條件以及開始處理時雌激素的抑制效果首先表現(xiàn)在基因水平而GnRH蛋白表達(dá)較滯后有關(guān)。

4.2　雌激素處理對GT1-7細(xì)胞GnRH、KISS-1、ERα和GPR54 mRNA表達(dá)的影響

研究表明，雌激素對GnRH的分泌有兩種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制：一是正反饋，即一定水平的雌激素能夠促進(jìn)GnRH的分泌；一是負(fù)反饋，即雌激素也能抑制GnRH的分泌[15]。本實(shí)驗(yàn)條件下，雌激素處理抑制了GnRH分泌以及GnRHmRNA表達(dá)，與GnRH分泌開始出現(xiàn)顯著降低的時間(18h)相比，GnRHmRNA在培養(yǎng)6 h即出現(xiàn)顯著降低，提示 GnRH分泌的抑制效果首先表達(dá)在mRNA表達(dá)水平，GnRH分泌滯后于GnRHmRNA表達(dá)。表明1 μmol/L的雌激素是通過下調(diào)GnRHmRNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)對GnRH分泌的調(diào)控。

本實(shí)驗(yàn)雌激素處理濃度(1 μmol/L)較Tonsfeldt(100 pmol/L)[11]、Otani(1～100 nmol/L)等[13]的研究中使用的濃度都高，結(jié)果表明相較于對照組，處理組ERαmRNA表達(dá)極顯著降低，提示雌激素通過下調(diào)ERα基因表達(dá)抑制GnRH分泌，ERα在調(diào)控GnRH合成分泌中具有重要作用。研究表明，下丘腦GnRH神經(jīng)元既表達(dá)膜受體(G蛋白偶聯(lián)雌激素受體，GPER)也表達(dá)核受體(雌激素受體ERs)，GnRH神經(jīng)元能通過GPER直接響應(yīng)高濃度雌激素而產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[16]。提示雌激素處理的效果不僅僅是ERs基因表達(dá)變化引起的，膜受體和其他細(xì)胞成分也參與了GnRH的調(diào)節(jié)[17-18]。Otani等[13]發(fā)現(xiàn)雌激素能很容易激活蛋白激酶的磷酸化，其中包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)酶(ERK1/ERK2)以及應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK/JNK)，但不包括分裂原激活的蛋白激酶(P38MAPK)信號，提示E2參與非基因組效應(yīng)的調(diào)控，雌激素對膜受體和細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答都具有調(diào)控作用。

GPR54(G protein-coupled receptor 54)蛋白是KISS-1基因編碼的Kisspeptin的受體[19]，Kisspeptin能夠促進(jìn)動物GnRH的釋放[20]，通過GPR54發(fā)揮生物學(xué)活性[21]。研究發(fā)現(xiàn)，動物性成熟前后下丘腦KISS-1及GPR54 mRNA表達(dá)較幼年期顯著增加[22]。給幼年階段末期的靈長類動物和大鼠持續(xù)注射Kisspeptin-10能提前引發(fā)和青春期開始時一樣的GnRH 分泌[19,23]。可見KISS-1及其受體GPR54在動物初情期啟動和生殖上具有不可缺少的作用[24]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)1 μmol/L E2能夠抑制GT1-7細(xì)胞GPR54和KISS-1 mRNA表達(dá)。GPR54 mRNA極顯著降低的時間(6、12和24 h)早于且持續(xù)時間長于KISS-1 mRNA顯著降低的時間(12 h)，表明GPR54 對GnRH分泌減少的響應(yīng)可能較KISS-1表達(dá)產(chǎn)物kisspeptin敏感以及持久。Funes等[25]研究發(fā)現(xiàn)GPR54突變小鼠的表型與缺乏性腺類固醇激素小鼠一致，即雌性不能受孕，雄性無法產(chǎn)生精子，可能是GPR54突變導(dǎo)致GnRH分泌異常所致。Kisspeptin能刺激動物促性腺激素的分泌[26]，但Tena-sempere[23]發(fā)現(xiàn)kisspeptin對LH釋放的影響在敲除GPR54基因的小鼠沒有表現(xiàn)，說明Kisspeptin對促性腺激素釋放的影響只通過GPR54來調(diào)控。Parhar等[27]發(fā)現(xiàn)約50%的GnRH神經(jīng)元都表達(dá)GPR54，提示Kisspeptin也可直接作用于GnRH神經(jīng)元調(diào)控GnRH的釋放?？梢奒isspeptin對GnRH神經(jīng)元分泌的影響可能是與其受體GPR54結(jié)合，引起其他細(xì)胞內(nèi)信使的釋放，進(jìn)而間接調(diào)控GnRH釋放，也可能是Kisspeptin可通過GPR54直接作用于GnRH神經(jīng)元。

Kisspeptin對GnRH神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用可能部分依賴雌激素活性，100 nmol/L的雌激素和10 nmol/L的Kisspeptin同時處理GT1-7細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)提高GnRH、ERα及ERβmRNA表達(dá)[12]。研究表明雌激素與其受體ERα結(jié)合調(diào)控KISS-1 mRNA的表達(dá)，能對GnRH神經(jīng)元提供更強(qiáng)的刺激信號[28]。提示nmol/L級E2和Kisspeptin在調(diào)控GnRH神經(jīng)元活性上具有協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能的原因是高濃度的雌激素通過抑制ERα表達(dá)，下調(diào)KISS-1/GPR54系統(tǒng)，進(jìn)而抑制GnRH合成和分泌。其完整的通路和具體的作用機(jī)制還需在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究。

5　結(jié)論

雌激素(1 μmol/L)能夠抑制GT1-7細(xì)胞脈沖式分泌GnRH，且在18和30 h抑制效果達(dá)到極顯著。雌激素可能通過影響GnRH、ERα、KISS-1和GPR54的表達(dá)調(diào)控GT1-7細(xì)胞GnRH的合成和分泌，進(jìn)而調(diào)控生殖系統(tǒng)。

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